第一节  病毒的细胞培养

    病毒为严格细胞内寄生，培养病毒必须使用细胞。实验动物、鸡胚等都拥有大量活的细胞，可用于病毒培养。尤其是SPF动物或SPF鸡胚，目前仍然经常作为培养病毒之用，但是发展最快的技术是细胞培养。

一、细胞培养的特点

    体外培养动物组织在100多年前已获成功，直到20世纪50年代采用了将组织细胞分散的技术，使组织培养变为细胞培养，得以应用于病毒学研究、诊断及疫苗制备等方面。组织培养 （tissue culture）和细胞培养（cell culture）在此领域基本是同义词，前者包括后者。

    细胞培养中的每个细胞的生理特性基本一致，对病毒的易感性也相等，没有实验动物的个体差异。而且可用于试验的数量远远超过动物或鸡胚，并且可在无菌条件下进行标准化的试验，可重复性好。

    感染病毒的细胞可通过观察细胞产生的变化如细胞病变等来判定结果，也可结合免疫学技术检测细胞内是否有所培养的病毒。

    细胞培养的重要用途之一是从感染的动物组织内分离病毒以及病毒克隆。从样本分离的病毒可能不是单一的毒株，需要克隆以求纯化。通过细胞培养挑选产生的空斑可达到克隆的目的。

二、细胞培养的类型

    1．原代细胞（primary ce11）  动物组织经胰蛋白酶等消化、分散，获得单个细胞，再生长于培养器皿中。大多数组织均可制备原代细胞，但生长的快慢及难易程度不一。肾和睾丸最为常用，甲状腺细胞生长较慢，只用于某些特定的病毒如猪传染性胃肠炎病毒的培养。原代细胞一般对病毒较易感，尤其是来源于胚胎或幼畜组织的细胞。最好用SPF动物的组织，以免携带潜伏的病毒，否则会影响所需病毒的生长，甚至造成灾难性后果。

    乙型及丙型疱疹病毒等如用患病动物的组织直接作原代培养，分离病毒往往较易成功。有的病毒则需采用组织块与细胞共培养（cocultivation）的方法才易分离成功，如犬瘟热病毒，可采用病犬脑组织小块与Vero细胞共培养。   

    2．二倍体细胞株（diploid cell strain）  将长成的原代细胞消化分散成单个细胞，继续培养传代，其细胞染色体数与原代细胞一样，仍为二倍体。此种细胞数量可扩大，对病毒的易感性则基本无变化。从样本中分离培养病毒，一般多采用此种细胞。但巨噬细胞、神经细胞等体外培养一般不分裂，很难获得二倍体细胞株。

    3．传代细胞系（estaLUshedcellline）  与上述两类细胞不同，这类细胞在体外可无限制分裂亦即可无限制传代。有的来源于肿瘤组织或转化的细胞，染色体数目不正常，为异倍体。传代培养方便是其优点，因此使用广泛。缺点是有的对分离野毒（即样本中的病毒）不敏感。因在实验室传代日久，有的可能污染霉形体或隐性感染的病毒，应予注意。由于担心致肿瘤的潜在危险，传代细胞系一般不能用于制备疫苗。传代细胞系均有通用的名称，如HeLa（人子宫癌细胞）、Veto（非洲绿猴肾细胞）、BHK-21（乳仓鼠肾细胞）、PK-15（猪肾细胞）等，并有专门机构负责鉴定和保管，如ATCC等。

三、细胞培养的方法

    最常用的方法为静置培养及旋转培养。为满足某些特定的需要，还可采用悬浮培养或微载体培养技术等。

    1．静置培养（stationary cultute）    将消化分散的细胞悬液分装于培养瓶（管）或培养板（孔），封闭，静置于恒温箱内，数天后细胞可生成贴壁的单层细胞。如用细胞培养板，一般需培养在含5%的CO₂条件下。哺乳动物及禽类的细胞培养温度一般为37℃，鱼类等变温动物则视其生存环境的温度而定，温水鱼细胞一般25-28℃，冷水鱼细胞15-20℃。昆虫细胞培养有特殊的培养条件。

    2．旋转培养（roller culture）  基本方法与静置培养相同，不同之处是要培养的细胞不是静置，而是使之不断缓慢旋转（5-10r/min），经过一段时间，细胞可在培养瓶（管）的四壁长满单层。此法的产量高，适用于疫苗生产。某些病毒如轮状病毒、冠状病毒，用旋转培养比静置培养分离野毒更易获得成功。

3．悬浮培养（suspensive culture）  通过搅拌使细胞处于悬浮状态，并补充营养和校正pH，使之生长或维持存活。此法 适用于某些不需要贴壁生长的细胞系，如NS-1（一种骨髓瘤细胞系），或作某种特殊研究之用。

  4．微载体培养（micro-carrierculture）  是在悬浮培养的基础上，结合微载体的细胞培养技术；微载体是直径35-100μm的微小颗粒，对细胞无毒性，细胞可贴附其上长成单层。由于微载体数量较大，所获得的细胞数也比上述常规方法大为增加，对规模化的细胞或疫苗生产很有吸引力，虽则增高了生产成本。此技术还适用于某些不能悬浮培养的细胞，如二倍体细胞等。微载体有多种型号，已商品化。