第四章 消毒与灭菌
微生物多为单细胞生物，具有表面积大、新陈代谢率高、繁殖快、适应能力强以及易变异等特点，故其生命活动极易受外界环境条件的影响。了解外界环境因素对微生物的影响，以便控制外界因素，达到充分利用微生物有利的一面，消灭其有害的一面，这无论在理论上还是在实践上都具有重要意义。
本章着重介绍物理、化学、生物学因素对微生物的抑制或杀灭作用以及消毒灭菌方法，在具体讨论这些内容之前，先简要地介绍几个基本概念。
1．杀菌作用（bacteriocidic action） 指某些物质或因素所具有的在一定条件下杀死微生物的作用。
2．抑菌作用（bacteriostatic action） 指某些物质或因素所具有的抑制微生物生长与繁殖的作用。
3．抗菌作用（antibiic action） 指某些药物所具有的抑制或杀灭微生物的作用。
4．灭菌（sterilization） 指杀灭物体中所有病原微生物和非病原微生物及其芽胞、霉菌孢子的方法。
5．消毒（disinfection） 指杀灭物体中的病原微生物的方法。消毒只要求达到消除传染性的目的，而对非病原微生物及其芽胞、孢子并不严格要求全部杀死。
6．防腐（antisepsis） 指阻止或抑制微生物生长繁殖的方法。
7．无菌（asepsis） 指没有活的微生物的状态。采取防止或杜绝任何微生物进入动物机体或其他物体的方法，称为无菌法。以无菌法进行的操作称为无菌技术或无菌操作。以无菌技术剖腹产取出分娩胎儿，并在无菌条件下饲喂的动物，称无菌动物。
第一节 物理因素对微生物的影响
对微生物影响较大的物理因素包括：温度、辐射、干燥、声波、微波、滤过等。
一、温度
不同温度对微生物生命活动呈现不同的作用。适当的温度有利于微生物的生长发育，但温度过高或过低都会影响微生物的新陈代谢，生长发育受到抑制，甚至使之死亡。
（一）低温对微生物的影响 大多数微生物对低温具有很强的抵抗力，如伤寒沙门氏菌置于液氮（－195.8℃）中其活力不受破坏，许多细菌在－20℃或－70-50℃下存活；细菌芽胞和霉菌孢子可在－195.8℃下存活半年。温度愈低病毒存活的时间也愈长。当微生物处于最低生长温度以下时，其代谢活动降低到最低水平，生长繁殖停止，但仍可长时间保持活力。所以，常在5-10℃下来保存细菌。也有些细菌如脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）、流感嗜血杆菌（haemophilus influenza）等对低温特别敏感，在冰箱内保存比在室温下保存死亡更快。
（二）高温对微生物的影响 高温对微生物具有明显的致死作用，因此最常用于消毒和灭菌。用高温处理微生物时，可对菌体蛋白质、核酸、酶系统等产生直接破坏作用，热力可使蛋白质中的氢键破坏使之变性或凝固，使双股DNA分开为单股，受热而活化的核酸酶使单股的DNA断裂，导致菌体死亡。
热力灭菌法分干热灭菌和湿热灭菌两类。在同一温度下，后者效力比前者为大，这是因为湿热中菌体蛋白较易凝固。蛋白质含水量愈高，凝固所需的温度愈低（表3-1）；其次湿热的穿透力比干热强；而且蒸汽可以释放大量潜热，可迅速提高被灭菌物体的温度。
1．干热灭菌法（dry heat sterilization） 包括火焰灭菌和热空气灭菌两类。
⑴火焰灭菌法 以火焰直接烧灼杀死物体中的全部微生物的方法。分为灼烧和焚烧两种，灼烧主要用于耐烧物品，直接在火焰上烧灼，如接种针（环）、金属器具、试管口等的灭菌；焚烧常用于烧毁的物品，直接点燃或在焚烧炉内焚烧，如传染病畜禽及实验感染动物的尸体、病畜禽的垫料以其他污染的废弃物等的灭菌。
⑵热空气灭菌法 利用干热灭菌器，以干热空气进行灭菌的方法。适用于高温下不损坏、不变质的物品，如各种玻璃器皿、瓷器、金属器械等的灭菌。在干热情况下，由于热空气的穿透力较低，因此干热灭菌需在160℃维持1-2h，才能达到杀死所有微生物及其芽胞、孢子的目的。灭菌时，要使温度逐渐升降，切忌太快。
2．湿热灭菌法（moist heat sterilization） 常用的湿热灭菌有如下几种。
⑴煮沸灭菌 煮沸10-20min可杀死所有细菌的繁殖体，芽胞常需煮沸1-2 h才被杀死。若在水中加入1%碳酸钠或2%-5%石炭酸，可以提高沸点，加强杀菌力，加速芽胞的死亡，灭菌的效果更好。外科手术器械、注射器、针头以及食具等多用此法灭菌。
⑵巴氏消毒法（pasteurization） 以较低温度杀灭液态食品中的病原菌或特定微生物，而又不致严重损害其营养成分和风味的消毒方法。由巴斯德首创，用以消毒乳品与酒类，目前主要用于葡萄酒、啤酒、果酒及牛乳等食品的消毒。具体方法可分为三类，第一类为低温维持巴氏消毒法（low temperature holding pasteurization，LFH），在63-65℃保持30min；第二类为高温瞬时巴氏消毒法（high temperature short time pasteurization，HTST），在71-72℃保持15s；第三类为超高温巴氏消毒法（ultra high temperature pasteurization，UHT），在132℃保持1-2s，加热消毒后应迅速冷却至10℃以下，称为冷击法，这样可进一步促使细菌死亡，也有利于鲜乳等食品马上转入冷藏保存。超高温巴氏消毒的鲜乳在常温下，保存期可长达半年。
⑶流通蒸汽灭菌法 是利用蒸汽在蒸笼或流通蒸汽灭菌器内进行灭菌的方法，也称间歇灭菌法 （fractional sterilization）。100℃的蒸汽维持30min，足以杀死细菌的繁殖体，但不能杀灭芽胞和霉菌孢子。故常将第一次灭菌后的物品置温箱中过夜，待芽胞萌发出芽，第二天和第三天以同样方法各进行一次灭菌和保温过夜，以达到完全灭菌的目的。此法常用于一些不耐高温的培养基，如鸡蛋培养基、血清培养基、糖培养基的灭菌。如将物品在70-80℃加热1h，连续6次，也可达到灭菌的目的，且可不破坏血清等。根椐灭菌对象不同，使用温度、加热时间、连续次数，均可适当增减。
⑷高压蒸汽灭菌法 即用高压蒸汽灭菌器进行灭菌的方法，是应用最广泛的、最有效的灭菌方法。在一个大气压下，蒸汽的温度只能达到100℃，当在一个密闭的金属容器内，继续加热，由于蒸汽不断产生而加压，随压力的增高其沸点温度也升至100℃以上，以此提高灭菌的效果。高压蒸汽灭菌器（autoclave）就是根据这一原理设计的。通常用1.02 kg/cm2（约0.107 Mpa，旧称每平方英寸15磅）的压力，在121.3℃温度下维持15-20min，即可杀死包括细菌芽胞在内的所有微生物，达到完全灭菌的目的。凡耐高温、不怕潮湿的物品，如各种培养基、溶液、玻璃器皿、金属器械、敷料、橡皮手套、工作服和小实验动物尸体等均可用这种方法灭菌。所需温度与时间视灭菌材料的性质和要求决定。
应用此法灭菌，一定要充分排除灭菌器内原有的冷空气，同时还要注意灭菌物品不要互相挤压过紧，以保证蒸汽通畅，使所有物品的温度均匀上升，才能达到彻底灭菌的目的。若冷空气排不净时，压力虽达到规定数字，但其内温度却实际不足，会影响灭菌的效果。为此而设计制造的预真空高压蒸汽灭菌器，可以保证灭菌的效果。
二、辐射
辐射包括电磁波辐射和粒子辐射。电磁波辐射是由赫兹电波、红外线、可见光、紫外线、X射线、γ射线、宇宙线辐射构成；粒子辐射由α射线、β射线以及高能质子、中子等组成。α射线是带正电的质子，β射线是带负电的电子。
辐射是能量通过空间传递的一种物理现象。能量可借波动或粒子高速行进而传播，辐射除可被一些产色素细菌利用作为能源外，对多数细菌有损害作用。辐射对细菌的影响，随其性质、强度、波长、作用的距离、时间而不同，但必须被细菌吸收，才能影响细菌的代谢。辐射对微生物的灭活作用可分为电离辐射和非电离辐射两种。非电离辐射包括可见光、日光、紫外线。
1．可见光线 是指在红外线和紫外线之间的肉眼可见的光线，其波长400-800nm。可见光线对微生物一般无多大影响，但长时间作用也能妨碍微生物的新陈代谢与繁殖，故培养细菌和保存菌种，均应置于阴暗之处。
可见光具有微弱的杀菌作用，若将某些染料如结晶紫、美蓝、汞溴红、伊红、沙黄等加到培养基或涂在外伤表面，能增强可见光的杀菌作用，这一现象称为光感作用（photosensitization）。一般在有氧的情况下才出现光感作用，这与染料激活氧或染料氧化后生成氧化物而起杀菌作用有关。光感作用对原生动物、细菌、毒素、病毒和噬菌体等均有灭活作用。革兰氏阳性菌对光感作用比革兰氏阴性菌敏感。伊红、汞溴红和美篮仅作用于革兰氏阳性菌，而沙黄则作用于革兰氏阴性菌。
2．阳光 直射日光有强烈的杀菌作用，是天然的杀菌因素。许多微生物在直射日光的照射下，半小时到数小时即可死亡。芽胞对日光照射的抵抗力比繁殖体大得多，往往需经20h才死亡。日光的杀菌效力因地、因时及微生物所处环境不同而异，烟尘严重污染的空气、玻璃、有机物的存在都能减弱日光的杀菌力。此外，空气中水分的多少，温度的高低以及微生物本身的抵抗力强弱等均影响日光杀菌作用。
在实际生活中，日光对被污染的土壤、牧场、畜舍、用具等的消毒以及江河的自净作用均具有重要的意义。
日光依光谱分为可见光和看不见的紫外线（波长13.6-400nm）与红外线（波长800-4×105nm），各具有不同的杀菌效力，其中紫外线是日光杀菌作用的主要因素，红外线则因产生高热而发挥杀菌作用。
3．紫外线 紫外线中波长200-300nm部分具有杀菌作用，其中以265-266nm段的杀菌力最强，这与DNA的吸收光谱范围一致。实验室通常使用的紫外线杀菌灯，其紫外线波长为253.7nm，杀菌力强而稳定。紫外线的穿透力不强，即使是很薄的玻璃也不能透过，所以只能用紫外线杀菌灯消毒物体表面，常用于微生物实验室、无菌室、手术室、传染病房、种蛋室等的空气消毒，或用于不能用高温或化学药品消毒物品的表面消毒。
紫外线的杀菌原理是细菌经紫外线照射后，由于DNA分子吸收260nm左右的紫外线，使同一条DNA链上相邻的两个胸腺嘧啶产生共价键而结合成二聚体，影响DNA复制与转录时的正常碱基配对，引起致死性突变而死亡。此外，紫外线还可使空气中的分子氧变为臭氧，臭氧放出氧化能力强的原子氧，也具有杀菌作用。
细菌受致死量的紫外线照射后，3h以内若再以可见光照射，则部分细菌又能恢复其活力，这种现象称为光复活作用（photore activation）。细菌所具有的光裂解酶（photolyase）和经紫外线照射过的DNA在黑暗中相结合，在可见光的协同作用下，酶和DNA又复解离，使形成胸腺嘧啶二聚体的DNA分子又恢复为正常分子结构。缺乏光复活酶的细菌，不具光复活能力。光复活作用最有效的可见光波长为510nm。
4．电离辐射 放射性同位素的射线（即α、β、γ射线）和X射线以及高能质子、中子等可将被照射物质原子核周围的电子击出，引起电离，故称之为电离辐射。
X射线（波长0.06-13.6nm）的杀菌力不如紫外线，作用也较慢，一般认为X射线的波长愈短杀菌力愈强。α与β射线的电离辐射作用较强，具有抑菌或杀菌作用；γ射线（波长0.001-0.4nm）的电离辐射作用弱，仅有抑菌作用和微弱的杀菌作用。但β与γ射线穿透力强。在实际工作中主要是X、γ和β射线，用于消毒、食品保藏和育种等方面。。射线、高能质子、中子等因缺乏穿透力而不实用。各种微生物对电离辐射的敏感性有很大的差异，也与它们的生理状态有关。电离辐射也可使补体、溶血素、酶、噬菌体及某些病毒失去活性。
一般认为，电离辐射的杀菌机制是射线使水电离为H+和OH—，这些游离基是强烈的还原剂和氧化剂，可直接作用于细菌本身。此外，射线作用于细菌周围液体内的氧分子，形成O2—、O2 2—、H2O、H2O2等氧化性基团，能使菌体内酶类的-SH基氧化而失去活性。射线直接作用于菌体时，可放出一个以上的能量量子（quanta of energy），可导致包括DNA在内的细胞内部物质分解，使细菌死亡或发生突变。
三、干燥
微生物在干燥的环境中失去大量水分，新陈代谢便会发生障碍，甚至引起菌体蛋白质变性和由于盐类浓度的增高而逐渐导致死亡。不同种类的微生物对干燥的抵抗力差异很大。巴氏杆菌、嗜血杆菌、鼻疽杆菌在干燥的环境中仅能存活几天，而结核杆菌能耐受干燥90d。细菌的芽胞对干燥有强大的抵抗力，如炭疽杆菌和破伤风梭菌的芽胞在干燥条件下可存活几年甚至数十年以上。霉菌的孢子对干燥也有强大的抵抗力。
由于微生物不能在干燥环境中生长繁殖，因此常用干燥法来保存食品、饲料、谷类、皮张、药材等。利用高浓度的盐溶液或糖溶液保存食品，是由于高浓度的溶液吸取菌体内的水分，造成微生物细胞的生理性干燥而达到抑菌的目的。
四、超声波
频率在20 000—200 000HZ的声波称为超声波。细菌和酵母菌在超声波作用下于几十分钟内死亡，大多数噬菌体和病毒对超声波也有一定的敏感性，但小型病毒对超声波不敏感，细菌的芽胞对超声波具有抵抗力。超声波处理虽可使菌体裂解死亡，但往往有残存者，又因超声波费用颇大，故未应用于消毒灭菌。目前主要用于裂解细胞，提取细胞组分，研究其抗原、酶类、细胞壁的化学性质以及从组织内提取病毒等。
五、微波
从几百兆赫至几十万兆赫频率的无线电波称为微波。微波灭菌，主要是利用微波的加热作用完成。当把灭菌的物品放在微波照射的交变电场中时，物品内部的分子随着电场的变化而相应的旋转振动起来，电场变化快，分子振动也就跟着快；但是，由于分子间的相互作用力即产生摩擦力，因此分子克服其摩擦力而产生热量，使整个物品则热起来，起到了摩擦加热灭菌的作用。这种灭菌法，所需时间短、加热均匀是其显著的优点。
微波加热的应用范围很广，除可用来对医药用品及其它物体进行灭菌外，还可用来加快免疫化学反应，如ELISA。
六、滤过除菌（sterilization byltration）
滤过除菌是通过机械阻留作用将液体或空气中的细菌等微生物除去的方法。但滤过除菌常不能除去病毒、霉形体以及细菌L型等小颗粒。
糖培养液、各种特殊的培养基、血清、毒素、抗毒素、抗生素、维生素、氨基酸等不能加热灭菌的液体常用滤过除菌。过去多用蔡氏滤器等，近年来常用可以更换滤膜的滤器或一次性滤器，滤膜孔径有0.45μm及0.20μm两种。另外，还可用于病毒的分离培养。利用空气过滤器可进行超净工作台、无菌隔离器、无菌操作室、实验动物室以及疫苗、药品、食品等生产中洁净厂房的空气过滤除菌。药品、食品、疫苗以及生物制品生产中洁净厂房空气洁净度按照环境控制区分类，划分为四个等级，洁净厂房内空气的尘粒数和微生物数应符合规定。不同产品生产或同一产品的不同工序，应根据各自要求，分别在相应的洁净级别区内生产。
