实验三 琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA
一、实验目的:
学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术,了解质粒DNA电泳条带的多态性
二、实验原理
DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。
在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中,除了超螺旋DNA外,还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA);如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快,开环与线状分子的泳动亦有差异,于是在电泳时会产生三个条带的现象。
三、试剂与仪器设备:
1. 质粒DNA
2. 琼脂糖
3. 6×载样buffer 0.25% 二甲苯青FF,0.25% 溴酚蓝,30% 甘油
4.50×TAE 电泳Buffer 12.2g Tris,2.85ml 冰醋酸,10ml 0.25 mol/L EDTA(pH8.0),加水至50ml。
5.溴化乙锭(EB)溶液 10mg/ml(避光保存),每100ml琼脂糖凝胶加5μl贮存液,即凝胶中EB终浓度为0.5μg/ml,此试剂为强致癌物,要戴手套操作,避免污染环境。
6. DNAMarker:共6条带,2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
7.各种国产移液器(10,20,100μl)
8.消毒的tips枪头
9.水平电泳槽和电泳仪
四、实验步骤
1、胶液的制备:称取0.4g琼脂糖,置于锥形瓶中,加入50ml 1×TAE稀释缓冲液,放电炉上加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。
2、胶板的制备:将有机玻璃胶槽两端分别用挡板隔出需要制胶的空间,将胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封挡板内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入1×TAE缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。
4、加样:取1μl DNA溶液与适量载样缓冲液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。质粒DNA加样完毕,选取一个未加样点样孔加入6ul DNA Marker。注意每加完一个样品要更换tip枪头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
5、电泳:加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在5V/cm。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2~25px时,停止电泳。
6、染色:未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室温下染色20-25分钟。
7、观察:在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。
[注意] EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。
五、实验结果分析
质粒DNA电泳条带的形态。根据DNA marker分析质粒DNA溶液大致的浓度。