【24秋】分子生物学实验

王鑫 彭晓珏 李绍波 欧阳解秀 黎玉

目录

  • 1 课程介绍
    • 1.1 课程介绍
  • 2 培养基的配制、菌株复壮及单菌落的获取
    • 2.1 LB培养基的配制、菌株的复壮及单克隆的获取
  • 3 质粒提取
    • 3.1 碱裂解法小量提取质粒DNA
  • 4 琼脂糖凝胶电泳
    • 4.1 DNA的琼脂糖凝胶电泳分析
  • 5 质粒酶切及PCR
    • 5.1 质粒DNA的限制性酶切、PCR扩增与检测
  • 6 感受态细胞的制备
    • 6.1 感受态细胞的制备
  • 7 质粒DNA的转化
    • 7.1 质粒DNA的转化
  • 8 植物基因组DNA的提取
    • 8.1 CTAB法提取植物基因组DNA
  • 9 植物RNA的提取
    • 9.1 植物叶片RNA提取及检测
  • 10 细菌染色体DNA的提取
    • 10.1 细菌染色体DNA的提取
  • 11 紫外分光光度法测定核酸质量
    • 11.1 紫外分光光度法测定核酸浓度
LB培养基的配制、菌株的复壮及单克隆的获取

实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取

一、实验目的

1、掌握菌株复壮、单菌落菌株获取的平板划线法基本原理与操作技能。

2、巩固LB培养基配制和高压灭菌操作技术。

二、实验基本原理

大肠杆菌细胞通常保存于-80度冰箱中,刚刚解冻后的大肠杆菌细胞活性往往是很低的,需要复壮后才适合用于感受态细胞制备等基因工程实验中。同时,基因工程实验中往往需要获取遗传背景单一的单菌落菌株,以利于实验结果的分析。平板划线法是大肠杆菌菌株复壮与单菌落菌株获取的重要方法,其基本原理是将混杂在一起的不同细菌或同种细菌中的不同细胞,通过在固体培养基平板表面上作多次划线浓度稀释,形成较多的独立分布的单个细胞,经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。通常认为这种来源于某个细胞的单菌落遗传背景单一,有利于基因工程实验结果分析。

三、实验材料、设备及试剂

1实验材料

大肠杆菌(E. coli DH5α菌株:R-M-Kan-

2、实验设备

恒温摇床,电热恒温培养箱,无菌工作台,高压灭菌锅

3、主要试剂

酵母提取物,蛋白胨,氯化钠,琼脂,卡那霉素

四、实验步骤

液体LBLuria-Bertain)培养基配方:
蛋白胨(typtone)1.0% 1 g/100ml
酵母提取物(Yeastextraction)   0.5% 0.5g/100ml
氯化钠             1.0% 1 g/100ml

PH7.0

固体LB培养基:100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉

请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药,防止药品相互污染!

(1)   每组按上述液体LB培养基配方,以配制100ml的量称取药品放入烧杯。

(2)   用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中,玻棒搅拌使药品完全溶解后用100ml量筒定容至100ml

(3)   pH试纸检测pH值,并用1 N NaOH1 N HCl调节pH值至7.0

(4)   100ml溶液分装入两个三角瓶,每瓶为50ml

(5)   按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中,以配制成两瓶50ml固体LB培养基。

(6)   两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。

(7)   把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中,盖上锅盖,以对称方式拧紧锅盖,打开排气阀通电加热,至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时,关闭排气阀。当高压锅温度(气压)指示器指示锅内温度升高至1210.1Mpa)时,调节电压(或利用手动开关电源的方式)使高压锅稳定在该温度(压力)下20 min,然后断开电源。待指示器指示压力降为0时,方可打开排气阀,然后再打开锅盖小心取出锅内物品。

(8)   取出三角瓶后,在酒精灯火焰旁进行下述操作。

(9)   取其中的一瓶直接倒培养皿,每皿倒入的量以刚好能在培养皿底铺展成薄薄的一层即可。每组倒1块培养皿,在皿盖上用记号笔写上“LB”及各组的标记。

(10)另外一瓶培养基待温度降低至60左右时(刚能感觉不烫手),向培养基中加入0.1ml 30mg/ml的卡那霉素(Kan)溶液,使培养基中Kan的终浓度为30mg/L。快速充分混匀后每组倒1块培养皿,在皿盖上标注“LB+及各组的标记。

(11)接种环蘸取菌液,密密划线。

(12)倒置于37恒温培养箱中进行培养。

(13)一天后观察菌落。