实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取
一、实验目的
1、掌握菌株复壮、单菌落菌株获取的平板划线法基本原理与操作技能。
2、巩固LB等培养基配制和高压灭菌操作技术。
二、实验基本原理
大肠杆菌细胞通常保存于-80度冰箱中,刚刚解冻后的大肠杆菌细胞活性往往是很低的,需要复壮后才适合用于感受态细胞制备等基因工程实验中。同时,基因工程实验中往往需要获取遗传背景单一的单菌落菌株,以利于实验结果的分析。平板划线法是大肠杆菌菌株复壮与单菌落菌株获取的重要方法,其基本原理是将混杂在一起的不同细菌或同种细菌中的不同细胞,通过在固体培养基平板表面上作多次划线浓度稀释,形成较多的独立分布的单个细胞,经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。通常认为这种来源于某个细胞的单菌落遗传背景单一,有利于基因工程实验结果分析。
三、实验材料、设备及试剂
1、实验材料
大肠杆菌(E. coli) DH5α菌株:R-,M-,Kan-
2、实验设备
恒温摇床,电热恒温培养箱,无菌工作台,高压灭菌锅
3、主要试剂
酵母提取物,蛋白胨,氯化钠,琼脂,卡那霉素
四、实验步骤
液体LB(Luria-Bertain)培养基配方:
蛋白胨(typtone)1.0% (1 g/100ml)
酵母提取物(Yeastextraction) 0.5% (0.5g/100ml)
氯化钠 1.0% (1 g/100ml)
PH7.0
固体LB培养基:每100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉
请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药,防止药品相互污染!
(1) 每组按上述液体LB培养基配方,以配制100ml的量称取药品放入烧杯。
(2) 用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中,玻棒搅拌使药品完全溶解后用100ml量筒定容至100ml。
(3) pH试纸检测pH值,并用1 N NaOH或1 N HCl调节pH值至7.0。
(4) 将100ml溶液分装入两个三角瓶,每瓶为50ml。
(5) 按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中,以配制成两瓶50ml固体LB培养基。
(6) 两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。
(7) 把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中,盖上锅盖,以对称方式拧紧锅盖,打开排气阀通电加热,至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时,关闭排气阀。当高压锅温度(气压)指示器指示锅内温度升高至121℃(0.1Mpa)时,调节电压(或利用手动开关电源的方式)使高压锅稳定在该温度(压力)下20 min,然后断开电源。待指示器指示压力降为0时,方可打开排气阀,然后再打开锅盖小心取出锅内物品。
(8) 取出三角瓶后,在酒精灯火焰旁进行下述操作。
(9) 取其中的一瓶直接倒培养皿,每皿倒入的量以刚好能在培养皿底铺展成薄薄的一层即可。每组倒1块培养皿,在皿盖上用记号笔写上“LB”及各组的标记。
(10)另外一瓶培养基待温度降低至60℃左右时(刚能感觉不烫手),向培养基中加入0.1ml 30mg/ml的卡那霉素(Kan)溶液,使培养基中Kan的终浓度为30mg/L。快速充分混匀后每组倒1块培养皿,在皿盖上标注“LB+”及各组的标记。
(11)接种环蘸取菌液,密密划线。
(12)倒置于37℃恒温培养箱中进行培养。
(13)一天后观察菌落。