一、教学目标

1.了解核苷酸的化学结构及化学性质；

2.掌握核酸二、三级结构及其碱基配对规律；

3.分析比较核酸分子的组成和结构上的特点；

4.联系实际理解核酸性质和生物学功能之间的关系。

二、教学重点

1.碱基、核苷酸的结构、性质

2.核酸的结构、性质和生物功能。

三、教学难点

1 .DNA的结构

2 .RNA的结构

3 .Sanger法测序

核酸的性质

一、解离性质

多聚核苷酸有两类可解离的基团：磷酸和碱基能发生两性解离。

磷酸是中等强度的酸，碱基的碱性较弱，因此，核酸等电点在较低的pH范围内。

DNA等电点  4—4.5

RNA 等电点 2—2.5

RNA链中，核糖C’2-OH的氢能与磷酸酯中的羟基氧形成氢链，促进磷酸酯羟基氢原子的解离。

二、水解性质

1、碱水解

室温，0.1mol/LNaOH可将RNA完全水解，得到2’-或3’-磷酸核苷的混合物。

在相同条件下，DNA不被水解。这是因为RNA中C’2-OH的存在，促进了磷酸酯键的水解。

DNA、RNA水解难易程度的不同具有极为重要的生理意义。

DNA稳定 ，遗传信息。

RNA是DNA的信使，完成任务后降解。

2、酶水解

生物体内存在多种核酸水解酶

RNA水解酶  RNase

DNA水解酶  DNase

核酸外一切酶

核酸内切酶  最重要的：限制性核酸内切酶

三、光吸收性

碱基具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有强烈的光吸收，λmax=260nm

1、鉴定纯度

纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85），若大于1.8，表示污染了RNA。

纯RNA的A260/A280应为2.0。

若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。

2、含量计算

1 ABS值相当于：50ug/mL双螺旋DNA

                  或：40ug/mL单螺旋DNA（或RNA）

                  或：20ug/mL核苷酸

3、增色效应与减色效应

增色效应：在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大

减色效应：在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小。

四、沉降特性（DNA）

不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），起密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心就可以将它们区分开来，这一方法常用于质粒DNA的纯化。

相对沉降常数

线型双螺旋分子                1.00

松驰双链闭环                  1.14

切刻双链环                    1.14

单链环                        1.14

线型单链                      1.30

正超或负超螺旋双链环状        1.41

坍缩                          3.0

五、变性、复性及杂交

变性、复性是核酸的重要的物化性质，相对蛋白质来说，核酸可以耐受反反复复的变性、复性。这也是核酸研究技术的基础。

1、变性

（1）变性：

核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。多核苷酸骨架上共价键的断裂称核酸的降解。

DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。

           热变性因素     

           酸碱变性（pH小于4或大于11，碱基间氢键全部断裂）

           变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）  

变性后：粘度降低、浮力密度升高、260nm光吸收值增加、二级结构改变，部分失活

（2）熔解温度（Tm）或称熔点：

DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。DNA的Tm一般在70—85℃之间。

浓度50ug/mL时，双链DNA  A260=1.00，完全变性（单链）A260= 1.37当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。

（3）影响DNA的Tm值的因素

①DNA均一性   均一性高，熔解过程发生在很小的温度范围内。

②G-C含量与Tm值成正比，G-C含量高，则Tm越高，测定Tm，可推知G-C含量。

G-C%=（Tm-69.3）×2.44

③介质中离子强度

其它条件不变，离子强度高，Tm高。

2、复性

变性DNA在适当（一般低于Tm20—25℃）条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构。

变性DNA在缓慢冷却时（快速冷却可防止复性），可以复性。DNA片段越大，复性越慢；DNA浓度越大，复性越快。

复性速度可用Co·t衡量。

Co为变性DNA原始浓度mol·L-1，t为时间，以秒表示。

3、杂交（DNA—DNA、 DNA—RNA）

将不同来源的DNA混合加热，变性后，慢慢冷却使它复性。若这些异源DNA之间，在某些区域有相同的序列，则复性时会形成杂交分子。

4、分子杂交

⑴、Southern Blotting

Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位。

可用DNA或RNA探针。

⑵、Northern Blotting

研究对象是mRNA

检测可与探针DNA同源杂交的mRNA分子的存在，因而可以研究细胞内特定mRNA的产生，即特定基因的表达。

mRNA易形成局部二级结构，因此，总RNA或mRNA需在变性条件下电泳，乙二醛、甲醛可防止RNA形成二级结构。

⑶、Western Blotting

是研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。

扩展学习