一、教学目标                 

        1.掌握DNA的复制过程以及参与DNA复制的一些酶和蛋白质；

        2.真核生物与原核生物DNA复制的主要差异；

        3.逆转录的过程及其生物学意义。

二、教学重点 

         1. DNA合成的两条途径；

         2. DNA的损伤和修复。

        三、教学难点

比较分析DNA复制与逆转录的异同

DNA复制过程（E.coli.）

1、复制的起始

引发：当DNA的双螺旋解开后，合成RNA引物的过程。

引发体：引物合成酶与各种蛋白质因子（dnaB、dnaC、n、n＇n＇＇I）构成的复合体，负责RNA引物的合成。

引发体沿着模板链5’→3’方向移动（与冈崎片段合成的方向正好相反，而与复制叉移动的方向相同），移到一定位置上即可引发RNA引物的合成。

E.coli.DNA复制原点ori C，由245bp组成，三组13bp重复序列（近5^，端处），四组9 bp重复序列（另一端处）。

大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质：

DNaA	在原点处打开双螺旋
DNaB	使DNA解旋
DNaC	DNaB结合在原点所需
Hu	刺激起始
引物酶（DNaG）	合成RNA引物
SSB	结合单链DNA
RNA聚合酶	促进DNaA活性
旋转酶	松驰DNA扭曲应力

20个DnaA结合在四组9bp重复区，形成起始复合物，DNA环绕此复合物。

三组13bp重复区依次变性，产生开放型复合物。

DnaB（在DnaC协助下）与开放复合物结合，进一步解链。

2、DNA链的延长反应

前导链只需要一个RNA引物，后随链的每一个冈崎片段都需要一个RNA引物，链的延长反应由DNA pol.Ⅲ催化。

复制体：在DNA合成的生长点（既复制叉上）分布着许多与复制有关的酶和辅助因子，它们在DNA的模板链形成离散的复合物，彼此配合进行高度精确的复制，称为复制体。

复制体沿着复制叉方向前进就合成DNA。

3、RNA引物的切除及缺口补齐

DNA polⅠ的5^， → 3^，外切活力，切除RNA引物。

DNApolⅠ的5^， → 3^，合成活性补齐缺口。

4、DNA切口的连接

DNA ligase，动物、真核由ATP供能，原核由NAD供能。

5、DNA合成的终止

环状DNA、线性DNA，复制叉相遇即终止。

小结：

⑴ DNA解螺旋酶解开双链DNA。

⑵ SSB结合于DNA单链。

⑶ DNA旋转酶引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。

⑷ DNA引物酶(在引发体中)合成RNA引物。

⑸ DNA pol.Ⅲ在两条新生链上合成DNA。

⑹ DNA polⅠ切除RNA引物，并补上DNA。

⑺ DNA ligase连接一个冈崎片段。

DNA复制过程中，聚合酶对dTTP和dUTP的分辨能力高,有少量dUTP掺入DNA链中，此时，U-糖苷酶、AP内切酶、DNA polⅠ、DNA ligase共同作用，切除尿嘧啶，接上正确的碱基。

六、DNA复制的真实性

生物体DNA复制具有高度真实性，复制10⁷-10¹¹碱基对,只有一个错误碱基。

碱基对的自由能通常在4-13KJ/mol，这样的自由能相当于平均参入100个核苷酸就可能出现一次错配，仅靠Watson-Crick双螺旋的碱基配对原则，突变率将高达10^-2 。

1、DNA聚合酶对碱基的选择作用

酶的被动论：不同的核苷酸在聚合位点停留时间不同，正确的dNTP能长时间停留，而参与聚合。DNA聚合酶能依照模板的核苷酸，选择正确的dNTP掺入引物末端。

酶积极参与理论：DNA聚合酶对正确与错误的核苷酸，不仅亲和性不同，而且将它们插入DNA引物端的速度也不同。

动力学校正阅读：在新的磷酸二酯键未形成时，dNTP结合在酶与模板—引物复合物的聚合位点上，DNA聚合酶能识别正确与错误的dNTP。

DNA聚合酶对底物的识别作用，DNA聚合酶有两种底物，一种是DNA模板—引物，另一种是dNTP。

DNA聚合酶先识别DNA模板和引物的3^，未端，再识别底物dNTP，是一种有序的识别过程。

2、3^，→5^，外切活性的校正阅读

E. coli. DNA pol.Ⅰ和pol.Ⅲ有3^，→5^，外切活性，可删除错误插入的核苷酸。

缺失3^， →5^，外切活性的E. coli. DNA pol.Ⅰ，催化DNA合成时，出现错误的几率增高5-50倍。因此，3^，→5^，外切活性可以使DNA复制的真实性，提高1-2个数量级。

3、影响DNA合成真实性的因素

 ⑴高浓度NMP(如3^，-AMP, 5^，-GMP)

   NMP竞争酶的dNTP结合位点，抑制3^，→5^，外切活性。

 ⑵某一种dNTP浓度银高,可使引物3^，末端离开外切活性中心。

 ⑶dNTP 一般与二价阳离子结合成活化形式，Mg²⁺为主要的二价阳离子。当用其它二价阳离子（如Mn²⁺）代替Mg²⁺时，会改变酶的主体结构，影响聚合活性和3^，→3^，外切活性。

4、为什么用RNA引物

⑴从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配

⑵新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链，DNA聚合酶的5^，→3^，校对功能难发挥作用。

扩展阅读