第三节  骨髓细胞学检测

骨髓是人出生后的主要造血器官。骨髓检查的方法很多，主要包括：骨髓细胞形态学检查、骨髓细胞化学检查、骨髓病理学检查、细胞遗传学检查、细胞免疫学表型分析、造血细胞培养等。

一、骨髓细胞学检测的临床应用

骨髓细胞形态学检查是通过观察骨髓涂片中细胞的形态以及细胞间的比例关系来检查骨髓 细胞量和质的变化，是诊断造血系统疾病最常用的基本方法。

1. 骨髓细胞学检测的临床应用

(1)诊断造血系统疾病：这类疾病多数具有特征性细胞形态学改变，骨髓检查对这些疾病有一定的决定性诊断意义。如各种类型白血病、多发性骨髓瘤、巨幼细胞贫血、戈谢病(Gaucher disease)、尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)、海蓝色组织细胞增生症等。这些疾病也常通过复查骨髓象来评价疗效或判断预后。

(2)辅助诊断某些疾病：如各种恶性肿瘤的骨髓转移、淋巴瘤的骨髓浸润、骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性肿瘤、缺铁性贫血、溶血性贫血、脾功能亢进和免疫性血小板减少症。

(3)提高某些疾病的诊断率：利用骨髓液涂片检验疟原虫、黑热病原虫、红斑狼疮细胞及骨髓 液细胞培养进行染色体核型分析皆可提高阳性率。

2. 检查的适应证与禁忌证

(1)适应证：①外周血细胞成分及形态异常，如一系、二系或三系细胞的增多和减少；外周血中出现原始、幼稚细胞等异常细胞。②不明原因发热，肝、脾、淋巴结肿大。③骨痛、骨质破坏、肾功能异常、黄疸、紫癜、血沉明显增加、血浆蛋白异常、免疫球蛋白定量及构成异常等。④化疗后的疗效观察。⑤需要骨髓做标本的检查，如骨髓活检、造血祖细胞培养、染色体核型分析、微生物及寄生虫学检查(如伤寒、疟疾)等。

(2)禁忌证：由于凝血因子缺陷引起的出血性疾病如血友病；晚期妊娠的孕妇做骨髓穿刺术应 慎重。

二、骨髓细胞学检测的方法和内容

(一)肉眼观察

选择骨髓膜染色正常、厚薄适当、尽可能有骨髓小粒的涂片进行镜下观察。

(二)低倍镜下检查

1. 在进行骨髓细胞学检查之前先评价骨髓的取材、涂片、染色效果、细胞分布是否均匀，选择理想的染片进行检查。

(1)取材评价：良好的骨髓涂片可见骨髓小粒，镜下可见骨髓特有的细胞。

(2)涂片评价：涂片适当的骨髓片，镜下可见有细胞分散排列、不重叠的区域。

(3)染色评价：染色满意的骨髓涂片，镜下见细胞核、质颜色分明，颗粒清楚，整个涂片没有沉渣。

2. 估计骨髓有核细胞增生程度 在低倍视野(10×)下观察，骨髓中成熟红细胞与有核细胞的 大致比例判断骨髓增生程度；也可采用高倍视野(40×)下观察几个视野，得出平均每个高倍视野的 有核细胞数来判断。骨髓增生程度分五级，见表4-2-6。要观察多个、合适视野，并取其平均值。介于两者之间，增生程度往上提，因为骨髓穿刺抽吸的骨髓液有稀释的可能。

3. 计数巨核细胞数目  在低倍镜下计数全片巨核细胞数目，然后在油镜下(100×)确定其发育阶段。

4. 特殊细胞与其他 注意观察有无体积较大的特殊细胞，如转移到骨髓的癌细胞、大体积的淋巴瘤细胞、戈谢细胞、Niemann-Pick细胞等。

5. 血液寄生虫  对于不明发热病人，注意观察成熟红细胞内的疟原虫病原体、巨噬细胞内的黑热病原虫。

(三) 油浸镜检查

选择染色良好、细胞分布均匀、形态展示清楚的髓膜体尾交界处观察200～500个细胞，按细胞的种类、发育阶段分别计算，并计算它们各自的百分率；同时仔细观察各系统的增生程度和各阶段 细胞数量和质量的变化。

(四)骨髓象的分析与报告

包括骨髓有核细胞增生程度、粒细胞与有核红细胞比例、粒系统细胞改变、红系统细胞改变 (包括成熟红细胞)、巨核系统细胞改变、淋巴系统细胞改变、单核系统细胞改变和其他血细胞改变。巨核细胞单独计数并描述血小板分布状态。

三、血细胞发育过程中形态演变的一般规律

血细胞从原始到成熟的发育过程中(图4-2-5)，有一定的规律性，了解和熟悉这些规律对于辨认血细胞是十分必要的。

1. 细胞体积  随着血细胞的发育成熟，胞体逐渐由大变小。但巨核细胞体积通常由小变大，早幼粒细胞较原始粒细胞稍大。胞体大小变化的同时常发生形态变化如巨核细胞、单核细胞，从圆形或椭圆形变为不规则形。

2. 细胞质  ①量：由少逐渐增多，但淋巴细胞变化不大。②染色：由深蓝变浅染，甚至淡红，红细胞系最终变为橙红色。③颗粒：从无颗粒(原始细胞)→嗜天青颗粒(早幼粒细胞)→特异性颗粒(中性、 嗜酸性和嗜碱性颗粒)；单核细胞类似。但幼红细胞胞质内无颗粒，淋巴细胞除NK 细胞外也无颗粒。

3. 细胞核  ①大小：由大变小，由规则变为不规则，甚至分叶，但巨核细胞核由小变大；红细胞 系核变小，核形规则，成熟以后脱核。②染色质：由细致疏松逐渐变为粗糙、致密或凝集成块，着色由浅变深。③核仁：由有到无，经清晰、模糊不清至消失。④核膜：由不明显变为明显。

4. 细胞核/细胞质比例  由大变小，即由核大质少到核小质多。巨核细胞则相反。

四、血细胞的细胞化学染色

细胞化学染色是以细胞形态学为基础，根据化学反应原理，应用骨髓涂片按一定程序染色，然后在显微镜下观察细胞化学成分及其变化的一项检查方法。各种类型血细胞中的化学成分、含量及其分布不尽相同，在病理情况下，也可发生改变。因此，细胞化学染色有助于了解各种血细胞的化学组成及病理生理改变，可用作血细胞类型的鉴别，以及对某些血液病的诊断和鉴别诊断、疗效观察、发病机制探讨等有一定价值。

细胞化学染色的方法较多，主要介绍常用的酶类、脂类、糖原、铁等细胞化学染色。

(一)髓过氧化物酶染色

【原理】

血细胞中的髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)催化试剂中的联苯胺脱氢氧化并使其化学结构发生变化，与试剂中亚硝基铁氰化钠结合形成稳定的蓝黑色的颗粒，沉着于细胞质中。反应中脱去的氢传递给H₂O₂形成水。

【结果】

胞质中无蓝黑色颗粒者为阴性反应，出现细小颗粒、分布稀疏者为弱阳性反应，颗粒大而密集 者根据程度定为阳性、强阳性反应。

【临床意义】

主要用于急性白血病类型的鉴别。急性髓系白血病(AML) 中急性粒细胞白血病时，白血病细胞多呈阳性、强阳性反应(个别病例粒细胞发育处于偏早期阶段也会有偏弱的阳性)；急性单核细 胞白血病时，白血病细胞呈弱阳性或阴性反应；急性粒、单细胞白血病会出现阳性和弱阳性、阴性细胞并存的现象。急性淋巴细胞白血病(ALL) 时，白血病细胞呈阴性反应。MPO染色对急性粒细胞白血病、急性单核细胞白血病与急性淋巴细胞白血病之间的鉴别有价值。

(二)中性粒细胞碱性磷酸酶染色

【原理】

中性粒细胞碱性磷酸酶(neutrophil alkaline phosphatase,NAP)的显示方法有偶氮偶联法和钙钴法两种。前者的染色原理是血细胞内碱性磷酸酶在pH为9.4～9.6的条件下，将基质液中的α磷酸萘酚钠水解，产生α萘酚与重氮盐偶联形成有色沉淀，定位于细胞质内酶活性所在之处。

【结果】

NAP主要存在于成熟阶段的中性粒细胞(分叶核及杆状核)和巨噬细胞中，其他血细胞均呈阴性反应。阳性反应为胞质中出现浅到深的颜色沉淀物，反应强度分为5级，即“-”、“+”、“++”、 “+++”、“++++”。反应结果以阳性反应细胞百分率和积分值来表示。血涂片染色后，在油浸镜下，观察100个成熟中性粒细胞，阳性反应细胞所占百分率即为阳性率；对所有阳性反应细胞逐个按反应强度分级，将各级所占的百分率乘以级数，然后相加即为积分值。

【参考值】

成人NAP阳性率10%～40%;积分值40～80分。由于各实验室条件不同，参考值也有差异。 应建立本实验室的参考值。

【临床意义】

NAP活性可因年龄、性别、应激状态、月经周期、妊娠及分娩等因素有一定的生理性变化。在病理情况下，NAP活性的变化常有助于某些疾病的诊断和鉴别诊断。

1. 感染性疾病  细菌性感染时NAP活性明显增高，病毒性感染时其活性在正常范围或略 减低。

2. 慢性髓系白血病的NAP活性明显减低，积分值常为0。细菌感染引起的类白血病反应的NAP活性极度增高，故可作为与慢性髓系白血病鉴别的一个重要指标。

3. 急性粒细胞白血病时NAP积分值减低，急性淋巴细胞白血病的NAP积分值多增高，急性单核细胞白血病时一般正常或减低。

4. 再生障碍性贫血时NAP活性增高，阵发性睡眠性血红蛋白尿症时活性减低，因此也可作为两者鉴别的参考。

5. 其他血液病  一些成熟淋巴细胞的肿瘤如慢性淋巴细胞白血病、骨髓增殖性肿瘤如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、骨髓纤维化症等 NAP活性中度增高。

6. 腺垂体或肾上腺皮质功能亢进，应用肾上腺皮质激素、ACTH、 雌激素等NAP 积分值可增高。

(三)氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色

【原理】

氯乙酸AS-D萘酚酯酶(naphthol AS-D chloroacetate  esterase,AS-D NCE) 又称特异性酯酶 (specifie esterase,SE)、粒细胞酯酶。血细胞中的氯乙酸AS-D萘酚酯酶能将基质液中的氯乙酸AS-D萘酚水解，产生萘酚AS-D，后者与重氮盐GBC偶联，形成不溶性红色沉淀，定位于细胞质内。

【结果】

胞质中出现红色沉淀者为阳性反应。此酶主要存在于粒系细胞中，原始粒细胞为阴性反应或 弱阳性反应，自早幼粒细胞至成熟中性粒细胞均呈阳性反应，早幼粒细胞呈强阳性反应，酶活性随细胞的成熟而逐渐减弱。嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、浆细胞、幼红细胞均呈阴性反应，个别单核细胞可呈弱阳性反应。

【临床意义】

急性粒细胞白血病时原始粒细胞和早幼粒细胞酶活性明显增强，AS-DNCE染色呈强阳性反应；急性单核细胞白血病及急性淋巴细胞白血病时均呈阴性反应；急性粒、单核细胞白血病时，部分白血病细胞(粒系)呈阳性反应，而有些白血病细胞(单核系)呈阴性反应。

(四)α乙酸萘酚酯酶染色

【原理】

α-醋酸萘酚酯酶(alpha-naphthol acetate esterase,aNAE) 又称非特异性酯酶(non-specific esterase,NSE)、单核细胞型酯酶。α-醋酸萘酚酯酶能将基质液中的α-醋酸萘酚水解，产生α萘酚，再与重氮染料偶联，形成不溶性的有色沉淀，定位于胞质内。

【结果】

α-醋酸萘酚酯酶主要存在于单核系细胞中，胞质中出现有色沉淀者为阳性反应，因所用的重氮盐不同，阳性反应的沉淀可分灰黑色或棕黑色。原始单核细胞为阴性反应或弱阳性反应，幼稚单核细胞和单核细胞呈阳性反应。粒系细胞一般为阴性或弱阳性反应。淋巴细胞一般为阴性反应。

【临床意义】

急性单核细胞白血病细胞呈阳性或强阳性反应，但单核细胞中的酶活性可被氟化钠(NaF) 抑制，故在进行染色时，常同时做氟化钠抑制试验。急性粒细胞白血病时，呈阴性反应或弱阳性反应， 其阳性不被氟化钠抑制。本染色法主要用于急性单核细胞白血病与急性粒细胞白血病的鉴别。

(五)糖原染色

【原理】

糖原染色，又称过碘酸希夫反应(periodic acid-Schiff reaction,PAS 反应)。过碘酸能将血细胞内的糖原氧化生成醛基，醛基与Schiff液中的无色品红结合，形成紫红色化合物，定位于胞质内。

【结果】

胞质中出现红色者为阳性反应。阳性反应物可呈颗粒状、小块状或弥散均匀红色。PAS 反应的阳性程度通常以强阳性、阳性、弱阳性和阴性来表示。

正常血细胞的PAS染色反应：粒系细胞中原始粒细胞为阴性反应，自早幼粒细胞至中性分叶 核粒细胞均呈阳性反应，并随细胞的成熟，阳性反应程度渐增强；单核细胞呈弱阳性反应；淋巴细胞大多呈阴性反应，少数可呈弱阳性反应；幼红细胞和红细胞均呈阴性反应；巨核细胞和血小板均呈阳性反应，巨核细胞的阳性反应程度随细胞的发育成熟而增强，成熟巨核细胞多呈强阳性反应。

【临床意义】

1. 纯红白血病时病理性幼红细胞呈强阳性反应，有助于与其他良性红细胞疾病的鉴别，严重缺铁性贫血、重型海洋性贫血及巨幼细胞贫血，部分病例的个别幼红细胞可呈阳性反应。

2. 急性粒细胞白血病，原始粒细胞呈阴性反应或弱阳性反应，阳性反应物质呈细颗粒状或均匀淡红色；急性淋巴细胞白血病原始和幼稚淋巴细胞常呈阳性反应，阳性反应物质呈粗颗粒状或 块状；急性单核细胞白血病原始、幼稚单核细胞大多为阳性反应，呈弥散均匀红色或细颗粒状，有时在胞质边缘处颗粒较粗大。因此 PAS反应对三种急性白血病类型的鉴别有一定参考价值。

3. 其他  巨核细胞PAS染色呈阳性反应，有助于识别不典型巨核细胞，如急性巨核细胞白血病和MDS中的小巨核细胞；Gaucher细胞PAS染色呈强阳性反应，有助于与Niemann-Pick细胞鉴别；骨髓转移的腺癌细胞PAS呈强阳性反应。

几种常见类型急性白血病的细胞化学染色结果见表4-2-7。

(六)铁染色

【原理】

人体内的铁有一定量以铁蛋白和含铁血黄素的形式贮存在骨髓中的单核-巨噬细胞胞质内，幼红细胞的线粒体中也含有亚铁血红素。这些含铁物质在酸性条件下与亚铁氰化钾反应，生成蓝绿色的亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位，此染色法又称为普鲁士蓝反应。

【结果】

1. 细胞外铁  观察骨髓小粒中贮存在单核-巨噬细胞系统内的铁(在幼红细胞之外的铁)。阳性反应为骨髓小粒上见到的呈蓝绿色均匀的无形物质，或呈蓝绿色的小珠状、粗颗粒状或蓝黑色 的小块物质，按阳性反应的强度分为5级：

“-”骨髓小粒无蓝绿色显现(提示骨髓贮存铁缺乏)。

“+”有少量铁颗粒，或偶见少量铁小珠。

“++”有较多的铁颗粒和铁小珠。

“+++”有很多铁颗粒、小珠和少数蓝绿色小块。

“++++”有极多的铁颗粒和小珠，并有很多密集成堆的小块。

2. 细胞内铁 为幼红细胞内的铁，含有铁颗粒的幼红细胞称为铁粒幼红细胞。正常幼红细胞 (主要是晚幼红细胞)的细胞核周围可见到1~5个呈蓝绿色的细小铁颗粒。在油浸镜下连续计数100个幼红细胞，记录铁粒阳性的幼红细胞数，即为铁粒幼细胞所占的百分率。需同时注意细胞内的铁粒数目、大小、染色深浅和排列。如含蓝绿色铁粒在5个以上，并环绕细胞核排列1/2周以上者，称为环形铁粒幼红细胞。

【参考值】

1. 细胞外铁+~++,大多为++。

2. 细胞内铁20%～90%,平均值为65%,无环形铁粒幼红细胞。由于各实验室的实验条件不 同，此参考值也有差异。

【临床意义】

1. 缺铁性贫血时，早期骨髓中贮存铁就已耗尽，细胞外铁呈“-”。铁粒幼细胞百分率减低，常<15%,甚至为“0”。经铁剂治疗后，数天内铁小粒出现在幼红细胞中，但细胞外铁需补铁治疗一段时间后才会出现。因此铁染色是目前诊断缺铁性贫血及指导铁剂治疗的一项可靠和临床实用的检验方法。

2. 非缺铁性贫血，如慢性炎症性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血、铁粒幼细胞性贫血、溶血性贫血、巨幼细胞贫血、再生障碍性贫血及骨髓病性贫血等，细胞外铁多增加，常>+++~++++。

3. 铁粒幼细胞性贫血时，因血红素(heme) 合成障碍，铁利用不良，铁粒幼红细胞增多，可见到环形铁粒幼红细胞，占幼红细胞的15%以上。骨髓增生异常综合征(MDS) 伴环形铁粒幼红细胞 (MDS-RS)，环形铁粒幼红细胞>15%。