一 离心技术
研究细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体等细胞器和各种生物大分子的基本手段
高速离心机:转速10000~25000 r/min
超速离心机:转速超过25000 r/min,离心力大于89000 g,目前最高转速可达100000 r/min,离心力超过500000 g
二 差速离心
在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心,用于分离不同大小的细胞和细胞器。
细胞器沉降顺序:核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基体、核糖体。
差速离心只用于分离大小悬殊的细胞,更多用于分离细胞器,但只是初步分离,常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。
由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠,而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中,一般重复2~3次效果会好一些。
三 密度梯度离心
用介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度,细胞混悬液或匀浆置于介质顶部,通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。
常用介质为氯化铯,蔗糖和多聚蔗糖。
分离活细胞的介质要求:
-能产生密度梯度,且密度高时粘度不高
-pH中性或易调为中性
-浓度大时渗透压不大
-对细胞无毒
速度沉降
主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器
特点:介质密度较低,介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。
原理:生物颗粒(细胞或细胞器)在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。
2. 等密度沉降平衡
适用于分离密度不等的颗粒
特点:通常在较高密度的介质中进行,介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度,而且介质的梯度要求较高的陡度,不能太平缓
所需要的力场通常比速率沉降法大10~100倍,故往往需要高速或超速离心,离心时间也较长
原理:细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和是够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处,并停留在那里达到平衡。适于分离细胞器,而不太适于分离和纯化细胞
四 流式细胞术
对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术
包被细胞的液流(称为鞘液)通过高频振荡控制的喷嘴形成包含单个细胞的液滴,经激光束照射发出散射光和荧光,信号检测后送计算机处理
根据这些信号可分选出高纯度 (达99%)的细胞亚群
流式细胞仪:
当被荧光标记的细胞在流式细胞仪中的流动室里被流动液包裹,形成单细胞悬浮液。单细胞悬浮液逐一高速通过流式细胞仪的喷嘴,被激光激发就能够产生荧光。荧光的强弱与细胞内被标记的分子的含量相关。