一 细胞化学
为了对某些细胞成分进行定性和定位研究,可依据化学反应原理,采用组织化学和细胞化学染色方法(histochemical and cytochemicalstaining method)加以显示。
细胞化学染色是利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理,从而得以对某种成分进行研究和分析。
利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示,包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等各种组织化学显示法。
二 免疫细胞化学
是根据免疫学原理,利用抗体同特定抗原专一结合,对抗原进行定位测定的技术,常用的标记物有荧光素和酶。
免疫荧光法(immunofluorescent technique)以荧光素标记,常用的萤光素有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。
酶标免疫法(enzyme-labeled antibody method)使用酶标记,常用的酶有辣根过氧化物酶,酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物,从而显示出抗原存在的部位。
三 显微光谱分析
细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱,核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。例如,核酸的吸收波长为260 nm,而蛋白质的则为280 nm。
有的成分经组织化学染色后,对可见光有特定的吸收光谱。
根据细胞成分所具有的这种特性,可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性,甚至定量测定。
四 分子杂交技术
具有互补核苷酸序列的单链核苷酸片段,在适宜条件下通过氢键结合,形成DNA-DNA,DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。
原位杂交(in situ hybridization):用来检测染色体上的特殊DNA序列,最初使用放射性DNA探针,后发明免疫探针法。
Southern杂交:体外分析特异DNA序列的方法,以限制性内切酶将核或线粒体DNA切成片段,凝胶电泳分离后转移到醋酸纤维薄膜,用标记探针杂交,通过放射自显影辨认互补的特殊核苷序列。
五 PCR技术
聚合酶链式反应,将微量的目标DNA大量扩增
反应体系:①样品DNA;
②引物(primer),人工合成的一对寡核苷酸链(约15~20个核苷酸) ;
③4种dNTP;
④Tag DNA聚合酶,分离自嗜热水生菌(Thermus aquaticus),最适温度75~80℃,95℃下短时间不失活;
⑤适宜的缓冲体系和适量的Mg2+。
程序:变性(95℃)→退火(55℃)→延伸(72℃)