【重点提要】
根据细胞生物学学科特点、发展历史及当前研究进展，本章从细胞形态结构观察、细胞及其组分分析、细胞培养与细胞工程、细胞及生物大分子的动态变化等几个方面介绍细胞生物学主要研究方法。本章学习侧重于理解各种实验方法的基本原理及其应用。
【基本概念】
1. 显微镜分辨率(resolution)：是指能区分开两个质点间的最小距离。分辨率的高低取决于光源的波长λ，物镜镜口角α和介质折射率N。
2. 相差显微镜(phasecontrast microscope)：一种将相位差转变成振幅差的显微镜，可观察不染色的活细胞。
3. 激光共聚焦扫描显微镜 ( laser sanning confocal microscope)：用聚焦极好的激光束对样品单一景深的层面进行快速扫描，从而获得“光学切片”效果的显微镜。
4. 透射电子显微镜( transmissionelectron microscope)：通过穿透样品后的电子在显示屏上成像的显微镜。
5. 扫描电子显微镜(scanningelectron microscope)：利用电子在样品表面扫描产生二次电子成像的显微镜。
6. 免疫荧光技术(immunofluorescence)：利用偶联荧光分子的抗体与细胞或细胞切片进行孵育，使抗体和相应抗原结合，在荧光显微镜下对抗原进行定位的技术。如果用偶联荧光分子的一抗显示抗原，就是直接免疫荧光技术；如果是偶联荧光分子的二抗，则是间接免疫荧光技术。
7. 细胞系（cell line）：原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体；根据传代次数限制又可分为有限细胞系和连续细胞系。
8. 细胞融合（cellfusion）：两个细胞相互融合形成一个细胞的过程。融合后的细胞只有一个连续的细胞质膜。
9. 荧光漂白恢复技术（fluorescencephotobleaching recovery）：通过膜组分与荧光染料连接，用激光不可逆地漂白膜上的某一荧光区域，然后根据漂白区荧光恢复的速度，研究膜的流动性的技术。
10.荧光共振能量转移技术（fluorescenceresonance energy transfer）：用来检测活细胞内两种蛋白质分子是否直接相互作用的技术。当两个蛋白质相互作用时，供体被激发后所发出的荧光作为激发光激发受体产生荧光，即是荧光共振能量转移。
11.放射自显影技术（autoradiography）: 通过检测放射性标记物质在细胞内的定位来对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。结合脉冲标记，可以实现对细胞内生物大分子进行动态研究和追踪。
【知识点解析】
一、细胞形态结构的观察方法
(一)细胞形态结构观察手段
多数动植物细胞直径大约都在20-30μm，而裸眼的分辨率一般只有0.2 mm，很难识别单个细胞，更难识别细胞内的各种细胞器，因此必须借助显微镜才能够观察细胞的形态以及结构。
(二)显微镜的种类
主要有两类，即光学显微镜和电子显微镜
(三)光学显微镜
1. 普通复式光学显微镜
显微镜最重要的性能参数是分辨率（resolution），而不是放大倍数。分辨率是指能区分开两个质点间的最小距离。分辨率的高低取决于光源的波长λ，物镜镜口角α（标本在光轴上的一点对物镜镜口的张角）和介质折射率N（图3－3），它们之间的关系是：
D =0.61λ/N · sin (α/2)
通常α 最大值可达140°，空气中N ＝ 1，最短的可见光波长λ ＝ 450 nm，此时分辨率D ＝ 292 nm，约0.3 μm。若在油镜下，N 可提高到1.5，分辨率D 值则可达0.2 μm，所以普通光学显微镜的最大分辨率是0.2 μm。
普通光学显微镜虽然可以直接观察单细胞，但要获得好的效果，往往需要对细胞进行染色。如果是观察生物组织样品，则需要对对样品进行固定和包埋（常用的固定剂如甲醛，包埋剂如石蜡等），再将包埋好的样品切成厚度约5 μm 的切片，最后进行染色(如苏木精和伊红染色,又称H-E 染色）。固定的目的主要是为了保持样品固有成分及结构，而包埋的目的是为了便于显微切片。但这种固定和包埋往往让蛋白质的活性的丧失，因此，为了观察细胞内酶的分布，往往以冷冻的方式对样品进行包埋，然后冰冻切片。
2. 相差显微镜
由于生物样品一经固定就失去了生物活性，因此，对活细胞显微结构的观察可以借助相差显微镜（phase-contrast microscope）来观察。其原理是利用光波的基本属性包括波长、频率、振幅和相位等。可见光的波长和频率的变化表现为颜色的不同，振幅的变化表现为亮暗的区别，而相位的变化却是人眼不能觉察的。因此，当两束光通过光学系统时，会发生相互干涉。如果它们的相位相同，干涉的结果是使光的振幅加大，亮度增强。反之，就会相互抵消而亮度变暗。光线通过不同密度的物质时滞留程度不同，密度大则光的滞留时间长，密度小则光的滞留时间短，因而，其光程或相位发生了不同程度的改变，相差显微镜（包括干涉差显微镜）就是将光线的相位差转变为振幅差，增强样品的反差，从而实现对非染色活细胞的观察。实现这一改变需要相差显微镜在普通光学显微镜的基础上添加两个元件，即“环状光阑”和在物镜后焦面上的“相差板”。
3.荧光显微镜
与普通复式光学显微镜相比，荧光显微镜是通过激发光照射样品中能够产生荧光的分子，如荧光染料，而产生荧光成像。由于荧光显微镜的暗视野为荧光信号提供了很好的背景反差，因此，即便很弱的荧光信号也容易得以分辨。
荧光染料DAPI 能特异性地直接与细胞中的DNA 相结合，从而显示出细胞核或染色体在细胞中的定位。用显微注射器将标记荧光素的肌动蛋白注射到培养细胞中，可以看到肌动蛋白分子组装成肌动蛋白纤维的过程。用可产生荧光的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因与编码某种蛋白质的基因相融合，利用荧光显微镜，就可以在表达这种融合蛋白基因的活细胞中，观察到该蛋白的动态变化。为了观察某种特异蛋白，可以利用抗原抗体特异结合的原理，用荧光染料标记该种蛋白的抗体，然后用抗体与其孵育后在荧光显微镜下观察。如果待观察的蛋白含量在细胞中很少，还可通过用荧光染料标记二抗的间接免疫荧光技术来达到信号放大，以便观察。此外，还可以用GFP基因与待观察蛋白质的基因相融合并表达后进行荧光观察。
在显微镜构造方面，与普通光学显微镜相比，荧光显微镜的光源不同，并多了只允许某种波长的激发光波通过的激发滤光片以及可阻止短波长激发光而通过长波长荧光的双分镜。
4. 激光扫描共焦显微镜
普通显微镜，包括荧光显微镜，都存在许多来自样品中焦平面以外光的干扰，会使所观察图像的反差减小、分辨能力降低。而激光扫描共焦显微镜只让聚光镜聚焦在样品中某一位点上所产生的激发荧光成像，而来自焦平面以外的散射光则被小孔或狭缝挡住，因此，激光扫描共焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜的分辨率提高了1.4～1.7 倍。其二，因为激光扫描共焦显微镜可自动调节并改变观察的焦平面，所以可通过“光学切片”即改变焦点获得一系列不同切面上的细胞图像，经叠加后重构出样品的三维结构。
（四）电子显微镜
光学显微镜技术尽管样品制备相对简单、费用相对便宜，但其最大分辨率只有0.2 μm。这种分辨率对于观察细胞内的精细结构而言远远不够，只有借助电子显微镜。电子显微镜的高分辨率主要是因为使用了波长比可见光短得多的电子束作为光源，波长一般小于0.1 nm，分辨率可达0.2nm。根据电子显微镜成像原理的不同，有两种常用的电子显微镜。
1. 透射电子显微镜
透射电镜是利用穿透样品的电子打在荧光屏上进行成像。根据这一成像原理可知，透射电镜成像需要电子穿透样品。但一方面电子的穿透能力很弱，另一方面生物样品的组成特性决定了其对电子穿透能力差异不明显，因此，对于一般样品，即便是细胞，不仅需要切片，还需要染色。
透射电镜样品制备技术很多种，包括超薄切片、负染色、冷冻蚀刻、低温电镜等技术。 超薄切片的目的是为了电子能够穿透样品，而染色的目的是为了让样品形成电子密度反差。因此，一般光学显微镜染料不行，必须用重金属盐，如柠檬酸铅（易染蛋白质）、乙酸双氧铀（染核酸）等作为染料。通过重金属盐染色，可以让样品形成电子密度反差，电子密度大的地方通过的电子就少，打在荧光屏上就暗，相反，在荧光屏上就亮，从而形成明暗反差的放大了的图像。当然，如果样品足够小，比如病毒、核酸、蛋白质等，则可以通过负染色技术制样。负染所用的染料仍然是重金属盐。冷冻蚀刻技术比较复杂。简单地说，就是在低温下断裂细胞，然后通过让样品中的冰升华（蚀刻），再用重金属喷镀和形成碳膜来形成样品的复型膜，最后在透射电镜下观察。
2.扫面电子显微镜
如果说透射电镜是观察样品的内部结构，那么扫面电镜则是观察样品的表面形貌。扫面电镜的成像原理是利用电子枪发射出的电子束经电磁透镜汇聚成极细的电子“探针”，在样品表面进行“扫描”，激发样品表面放出二次电子。二次电子由探测器收集并被闪烁器转变成光信号，其产生的多少与样品表面的形貌相关。这样，通过扫描电镜可以得到样品表面的立体图像信息。
由于扫面电镜观察的是样品表面形貌，同样，由于电子的穿透能力和生物样品的组成特性，待观察的样品往往需要干燥、喷镀重金属等处理过程。而这些处理中，关键步骤就是干燥时如何保持样品的固有形貌，因为传统的干燥技术往往会由于水的表面张力导致样品形貌发生改变。为了避免水的表面张力存在，常用临界点干燥方法。
二、细胞及其组分的分析方法
为了揭示生物大分子在细胞内的空间定位、相互关系及其功能，在形态学观察的基础上往往还需要分析细胞组分。细胞组分的分析方法可以通过离心方法获得细胞组分，也可以在细胞原位进行分析。因为离心技术在生物化学等课程中已有详细阐述，以下重点介绍细胞及细胞组分的原位分析方法。
1. 细胞组分的细胞化学显示方法
如果是在细胞内原位分析细胞组分，可以利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和相对含量。如福尔根反应可以特异显示呈紫红色的DNA的分布；苏丹Ⅲ（深红色）染色则通过扩散进入脂滴中，使脂滴着色等。若在进行细胞中对某种酶进行定性研究时，样品制备需常采用冰冻切片，或以冷丙酮、甲醛进行短时间固定，以尽量保持酶的活性，然后将样品（细胞或组织切片）与适宜底物共同温育。
2. 特异蛋白的定位与定性
为了对细胞内某一种蛋白抗原进行特异性显示、定位或定性研究，可以利用抗原抗体特异性结合的原理，通过标记抗体，然后用标记的抗体与抗原结合进行观察分析。根据原位分析精度实验目的的不同，有光学显微镜水平和电子显微镜水平两种不同方法。
如前所述，利用光学显微镜进行特异蛋白的定位、定性研究需要对抗体进行荧光标记。如果用标记了荧光分子的一抗直接与抗原孵育，则是直接免疫荧光技术；若标记二抗后再与结合了抗原的一抗进行孵育，则是间接免疫荧光技术。
尽管免疫荧光技术快速、灵敏、特异性强，但其分辨率有限。因此，需要利用免疫电镜技术来有效地提高样品的分辨率，在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位。比如要确定某种蛋白定位在细胞何种细胞器上等等，用免疫电镜技术的精度明显比免疫光镜技术高。但免疫电镜技术制样复杂，现在也常用免疫光镜技术来粗略定位某种蛋白细胞内的分布等。根据电子显微镜的成像原理可知，用于标记抗体的物质不是荧光分子，而是重金属，如胶体金。
如果要定位或定性染色体上或细胞内特异核酸，仍然可以通过荧光原位杂交或者电镜原位杂交的方法达到目的。如果用荧光原位杂交方法进行研究，现在常用生物素标记的DNA探针与细胞内或染色体上核酸进行杂交，然后用荧光偶联的抗生物素抗体孵育；而用电镜原位杂交方法进行研究，则用胶体金偶联的抗生物素抗体进行显示。
3. 流式细胞分选技术
这一技术目前在科学研究中应用十分广泛。流式细胞术（flow cytometry）可定量地测定某一细胞中的DNA、RNA 或某一特异的标记蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量。比如要研究细胞群体中有多少细胞处于G1期、S期、G2/M期，则可将荧光抗体标记后的细胞用流式细胞仪进行大量而又快速的分析。同样，可通过流式细胞仪分析带有表面特定标志的细胞，如分选干细胞等。
三、细胞培养与细胞工程
1. 细胞培养
细胞培养是细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术。最近几年新兴的干细胞生物学发展及其应用在很大程度上仍然是得益于细胞培养技术的发展。
动物细胞若是从原代细胞培养做起，首先取出健康动物的组织块，剪碎，用浓度与活性适中的胰酶或胶原酶与EDTA（螯合剂）等将细胞连接处消化分散，给予良好的营养液与无菌的培养环境（接近体温与体内pH），在培养中进行静止或慢速转动培养。培养液一般都要加一定量的小牛（或胎牛）血清，因为血清中含有生长因子等成分，有利于细胞生长与增殖。原代培养的细胞一般传至10 代左右生长出现停滞，大部分细胞衰老死亡，但有极少数细胞可能渡过“危机”而传下去。这些存活的细胞一般又可顺利地传40～50 代次，并且仍保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制的行为。一般情况下（胚胎干细胞等除外），当细胞传至50 代以后又要出现第二次“危机”，难以再传下去。但在传代过程中如有部分细胞发生了遗传突变，并使其带有癌细胞的特点，有可能在培养条件下无限制地传代培养下去，这种传代细胞称为永生细胞系（infinite cell line），或连续细胞系（continuous cell line）。该细胞系细胞的根本特点是染色体明显改变，一般呈亚二倍体或非整倍体，失去接触抑制，容易传代培养。实验室常用的细胞系，如HeLa 细胞、CHO细胞等就是常用的连续细胞系，能在实验室无限传代培养。
以细胞培养为最基础，根据实验目的，可以用培养的细胞制样进行形态观察、结构观察、特异蛋白抗原定位定性、化学显色、原位杂交以及流式细胞分选，甚至进行细胞融合、显微注射以及研究大分子相互作用等。因此，细胞培养是细胞生物学中最基本的实验技术。
2. 单克隆抗体技术
所谓单克隆抗体，是指由单个细胞增殖形成的细胞克隆所分泌的抗体。该技术获得1984 年的诺贝尔生理学或医学奖。当动物受到外界抗原刺激后可激发B 淋巴细胞活化，产生相应的抗体。但在体内，这种来源的抗体不仅有限，而且往往是异质性抗体，限制了其实际应用。为了获得大量来源单一的抗体，1975 年，英国科学家C. Milstein 和G. J. F. Köhler将产生抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合，成功地建立了B 淋巴细胞杂交瘤技术（B-lymphocyte hybridomastechniques）用于制备单克隆抗体（monoclonal antibody）。
B淋巴细胞能够分泌抗体，但在体外培养时难以增殖。为了获得既能够分泌抗体又能够无限增殖的细胞克隆，将小鼠骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞（B 淋巴细胞）在聚乙二醇或灭活的病毒的介导下发生融合。融合后的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性，一方面可分泌抗绵羊红细胞的抗体，另一方面像肿瘤细胞一样，可在体外培养条件下或移植到体内无限增殖。尽管没有杂交的B淋巴细胞随着培养时间的延长将死亡，但要将没有融合的骨髓瘤细胞也淘汰掉而在培养体系中只剩下杂交瘤细胞则需要用缺陷型骨髓瘤和选择性培养基。正常细胞在氨基蝶呤的作用下可阻止细胞DNA合成主要通路，但可以利用次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷通过TK和HGPRT酶合成DNA。由于骨髓瘤细胞缺乏TK 或HGPRT，因此在含氨基蝶呤的培养液内不能通过旁路合成DNA而成活下来。只有融合细胞才能在含HAT（次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷）的培养液内通过旁路合成核酸而得以生存。通过HAT 选择培养和细胞克隆，可以获得能大量分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
四、细胞及生物大分子的动态变化
生物大分子动态变化是生命活动的表现，蛋白质与DNA相互作用可能与DNA复制和RNA转录活动相关，蛋白质与蛋白质相互作用可能与信号转导等生命活动相关，而微小RNA与mRNA相互作用与蛋白质翻译调控相关。因此，通过一些常用的研究生物大分子动态变化的方法对揭示细胞生命活动至关重要。
1. 荧光漂白恢复（fluorescence photobleaching recovery，FPR）
当高能激光束照射细胞表面某一特定区域后，该区域内被标记的荧光分子发生不可逆的淬灭，即光漂白（photobleaching）。随后，由于膜脂或膜蛋白的运动性，周围非漂白区的荧光分子不断向光漂白区迁移，使光漂白区的荧光强度逐渐地恢复到原有水平，这一过程称荧光恢复（fluorescence recovery）。荧光恢复的速度主要取决于膜脂或膜蛋白的运动速率。因此，该技术能定性定量分析膜脂或膜蛋白的运动。为了使膜脂或膜蛋白产生荧光，需要用荧光分子或绿色荧光蛋白标记待分析的膜成分。
2. 酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）
该技术主要分析蛋白—蛋白的相互作用。细胞基因转录起始需要转录激活因子，而转录激活因子一般由两个或两个以上在结构上可以分开、功能上相互独立的结构域组成，即DNA结合功能域和转录激活结构域。一旦这两个结合域分开后转录激活因子就不能激活基因转录，只有二者在空间上接近相互作用时，才能恢复其转录因子活性。因此，为了研究两种蛋白质是否相互作用，或者为了寻找与某种蛋白质相互作用的其他蛋白，可将待分析蛋白的基因与转录激活因子DNA结合域和转录激活结构域的基因分别生成融合基因，并导入酵母细胞表达。一旦待分析的蛋白相互作用，就会使DNA结合域和转录激活结构域相互靠近而启动报告基因的表达。酵母双杂交系统正是利用这个原理来研究蛋白质－蛋白质的相互作用。该实验系统有可能存在假阳性的问题。因此，在大量筛选出与某种蛋白可能真的相互作用的蛋白基础上，通过其他研究方法进一步确认，比如利用免疫共沉淀的方法进行分析。
3. 荧光共振能量转移（f luorescence resonance energytransfer，FRET）
用来检测活细胞内两种蛋白质分子是否直接相互作用的重要手段。如果一个荧光基团（供体）的发射光谱与另一个基团（受体）的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时（一般小于10nm）就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象。此时，用前一种基团的激发波长激发后可观察到后一个基团发射的荧光。这就是荧光共振能量转移现象。根据这一原理，将待研究的两种蛋白基因分别与CFP和YFP荧光蛋白基因融合并在细胞内共表达后，如果待研究的两种蛋白相互作用，其融合的CFP和YFP荧光蛋白也会近距离靠近，此时，用430nm的紫外激发光激发CFP后产生的490nm的蓝色荧光被YFP吸收，并产生530nm的黄色荧光，因此，根据根据有无黄色荧光的产生可以判断待研究的两种蛋白是否相互作用。
4. 放射自显影技术
除了生物大分子相互作用的分析方法外，还可以通过放射自显影技术实现对细胞内生物大分子的合成及分选路径追踪等。比如，用氚（3H）标记的胸腺嘧啶脱氧核苷（3H-TdR）做为DNA合成的前体物掺入细胞以研究DNA 合成，用氚标记的尿嘧啶核苷研究RNA 合成，用35S 标记的蛋氨酸和半胱氨酸、3H 或14C 标记的蛋氨酸、亮氨酸等研究蛋白合成分选以及代谢等。
五、模式生物
模式生物受到广泛深入研究，通常其个体较小，容易培养，操作简单，生长繁殖快等特点。细胞生物学乃至整个生命科学的研究中常用的模式生物有：噬菌体、大肠杆菌、酵母、四膜虫、黏菌、爪蟾、海胆、拟南芥、线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等。利用不同模式生物进行实验，可能结果会有所不同，因此，选择什么样的模式生物进行研究往往与实验内容以及实验目的有关。但总的来讲，由于不同生物往往享有或多少的共同代谢分子机制，因此，利用模式生物不仅可以很方便、很深入地开展研究，其研究结果往往还有助于解读生命活动现象。
