【重点提要】

细胞衰老的概念、特征；Hayflick界限；复制衰老分子机制的端粒假说。

细胞程序性死亡的概念；动物细胞凋亡、程序性坏死和植物细胞程序性死亡及其生物学意义；细胞凋亡的过程及其分子机制；引发caspases依赖性和非依赖性细胞凋亡的信号通路；细胞程序性坏死和植物细胞程序性死亡的分子机制。

【基本概念】

1．  细胞衰老（cell senescence）：也称为复制衰老（replicative senescence，RS），是指除了生殖干细胞，绝大多数正常细胞在经历有限次数的分裂后，不再具有增殖能力，细胞的形态结构和代谢活动也发生显著改变的现象。

2．  Hayflick 界限（Hayflick limit）：体外培养的正常细胞的寿命不是无限的，而只能进行有限次数的分裂。由美国生物学家Leonard Hayflick提出。

3．  衰老相关的β-半乳糖苷酶（senescence associated β-galactosidase,SABG）：衰老细胞中存在的pH6.0条件下即表现活性的β-半乳糖苷酶。正常细胞中β-半乳糖苷酶是溶酶体内的水解酶，通常在pH 4.0 的条件下表现活性。细胞固定后，用pH 6.0 的β-半乳糖苷酶底物溶液进行染色，就能明显区分年轻和年老的培养细胞。

4．  程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）：是由内在遗传机制控制的细胞主动性死亡方式；其形式多种多样，形态特征、分子机制和生理效应各异；对生物体的正常发育、自稳态平衡及多种病理过程具有重要意义。

5．  细胞凋亡（apoptosis）：程序性细胞死亡方式之一，是细胞接受某些特定信号刺激后，主动的由基因决定的细胞死亡方式。该过程具有典型的形态学和生化特征，凋亡细胞最后以凋亡小体形式被吞噬消化。

6．  细胞坏死（necrosis）：细胞受到意外损伤，如极端的物理、化学因素或严重的病理性刺激而发生的细胞死亡形式。细胞坏死时，细胞膜破裂，细胞内含物释放，引起周围组织发生炎症反应。有研究表明，细胞坏死也可能是 “程序性死亡”的另一种形式。

7．  程序性坏死（programmed necrosis）：由信号触发，细胞内不同信号传递分子介导，受到细胞内特异基因控制的细胞膜破裂的死亡过程；主要包括典型的程序性坏死（necroptosis）和细胞焦亡（pyroptosis）；可能在机体免疫反应中发挥重要作用。

8．  凋亡小体（apoptotic body）：细胞凋亡过程中，断裂的、大小不等的核染色质片段与某些细胞器聚集在一起，被反折的细胞质膜包裹，形成膜包裹的球形结构。将被邻近细胞或吞噬细胞吞噬，在溶酶体内被消化分解。

9．  Caspase蛋白酶（cysteine aspartic acid specific protease）：又称天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶，通常均以无活性的酶原形式存在于细胞质中，其活性位点均包含半胱氨酸残基，能特异地切割靶蛋白天冬氨酸残基后的肽键，使靶蛋白活化或失活，而非完全降解。按照功能可分为炎症caspase和凋亡caspase两大类，其中凋亡caspase又可分为起始caspase和效应caspase两类。

10．             Caspase激活的DNA内切酶（Caspase activated DNase，CAD）：是被caspase 活化的代表分子。一般与其抑制因子ICAD结合在一起，处于失活状态。细胞凋亡程序启动后，活化的Caspase-3降解ICAD，使CAD释放出来并在核小体间切割DNA，形成间隔200 bp或其倍数的DNA片段。

11．             DNA梯状条带（DNA ladder）：是细胞凋亡的典型特征之一。凋亡细胞内特异性DNA内切酶CAD活化，染色质DNA 被随机地在核小体间切割，降解成 180-200 bp 或其整数倍片段，经琼脂糖凝胶电泳分离呈现出的梯状条带。

12．             Caspase募集结构域（Caspase recruitment domain，CARD）：存在于凋亡起始caspase-2和9，以及凋亡相关接头蛋白分子中，通过结构域之间的聚合，Caspase能够彼此结合或与接头蛋白结合，被招募到上游信号复合物中活化。

13．             Apaf-1（apoptosis protease activatingfactor）：即凋亡蛋白酶活化因子1，是线虫凋亡分子Ced-4在哺乳动物细胞中的同源蛋白，N 端含有caspases 募集结构域。它与细胞色素c结合后发生自身聚合，形成凋亡复合体（apoptosome），通过CARD 结构域招募Caspase-9的酶原并使之活化，引发细胞凋亡。

14．             Bcl-2（B cell lymphoma gene 2）：是线虫凋亡抑制分子Ced9在哺乳动物细胞中的同源物，家族成员大多定位在线粒体外膜上，或受信号刺激后转移到线粒体外膜上，调控线粒体外膜通透性，促进或抑制细胞凋亡。按照功能，可将其分为3 个亚族：即Bcl-2 亚族、Bax 亚族和BH3 亚族。

【知识点解析】

（一）细胞衰老

1. 细胞衰老的概念

细胞衰老（cellsenescence）：也称为复制衰老（replicativesenescence，RS），即除了生殖干细胞，绝大多数正常细胞在经历有限次数的分裂后，不再具有增殖能力，细胞的形态结构和代谢活动也发生显著改变的现象。细胞衰老与G0 期的细胞静止（cellquiescence）状态不同，后者在特定生理条件下可以返回细胞周期继续增殖，而衰老细胞是不可逆地处于增殖停滞状态。

Hayflick 界限（Hayflick limit）：美国生物学家Leonard Hayflick实验证实，体外培养的正常细胞的寿命不是无限的，而只能进行有限次数的分裂增殖。

2. 细胞复制衰老的特征

衰老细胞的形态结构变化，如细胞变得大而扁平；质膜的流动性降低；细胞骨架结构改变；细胞黏附性增强；细胞内溶酶体体积增大，内部含有大量未分解的脂类成分如脂褐质（lipofuscin）等。

细胞衰老的分子特征：（1）细胞不可逆地停止分裂，即使添加生长因子也无济于事；（2）若干细胞周期的负调节因子如p21、p16、p53 表达上调或活性增强；（3）衰老相关的β-半乳糖苷酶（senescence associated β-galactosidase,SABG）活化；（4）衰老细胞端粒长度明显减少（短于原有长度的50%）；（5）出现衰老相关异染色质集中（senescence-associatedheterochromatin foci, SAHF）现象；（6）衰老细胞会产生一系列衰老特征性分泌物（senescence-associated secretory phenotype, SASP），包括炎性因子、金属蛋白酶等，招募免疫细胞前来吞噬衰老细胞，同时改变了周围细胞的微环境。

3. 细胞复制衰老的机制

1）端粒缩短引发细胞复制衰老的机制

端粒（telomere）的缩短能导致细胞衰老。在持续增殖的干细胞及癌细胞中存在端粒酶（telomerase），能以自身含有的RNA为模板，反转录出端粒DNA，从而避免端粒的缩短。而使癌细胞中的端粒酶失活能够导致癌细胞增殖停滞，引发癌细胞的衰老。大多数正常细胞中，端粒酶的活性很低，无法有效地延长端粒；而生殖干细胞及癌细胞中高活性的端粒酶使它们具有永生化（immortality）的增殖能力。

端粒的缩短通过p53信号通路引发细胞衰老的可能机制：端粒缩短或DNA 损伤→p53 活化→p21 表达→抑制CDK 活化→阻止Rb 蛋白磷酸化→Rb 不能与E2F分离→E2F 处于持续失活状态→G1/S 转换所需的若干关键因子不能转录→细胞停滞在G1/ S 期→细胞衰老。

2）胁迫诱导的早熟性衰老

细胞内一些刺激因素，如超量的过氧化物，原癌基因的非正常活化，非端粒的DNA 损伤（包括核DNA 和线粒体DNA损伤）等能够缩短细胞的复制寿命，使细胞提前进入衰老状态，这一类型的细胞衰老称为胁迫诱导的早熟性衰老（stress-induced premature senescence , SIPS）。SIPS 的发生是通过诱导周期抑制蛋白p16 表达，引发细胞周期停滞，导致细胞衰老。

4. 细胞衰老与个体衰老的关系

个体的衰老（aging）是指随着年龄的增加，机体功能呈现退行性变化的现象。细胞衰老是个体衰老的根源。

（二）多种形式的细胞死亡及其生物学意义

不同类型细胞在不同条件下表现出多种不同的程序性死亡方式，包括动物细胞的凋亡、程序性坏死、植物细胞的程序性死亡等，均受到基因控制。细胞程序性死亡是维持生物体正常生长发育及生命活动的必要条件。

1. 动物细胞的凋亡

细胞凋亡（apoptosis）是受基因调控的主动的生理性自杀行为。死亡细胞的质膜及溶酶体保持完整，细胞内含物不会释放到胞外，不会诱导机体发生炎症反应。动物细胞的凋亡是研究得最为深入的程序性死亡方式。

细胞凋亡的重要生理意义，主要表现在：（1）保证正常的胚胎发育进程，塑造个体及器官形态，形成免疫耐受；（2）维持生物体内的自稳态；（3）生理保护，肿瘤监控。

2. 程序性坏死

细胞坏死（necrosis）具有与细胞凋亡迥然不同的特征：细胞膜破裂，细胞内含物释放，周围组织发生炎症反应。细胞坏死曾长期被认为是一种被动的细胞死亡方式。近年的研究确立了细胞程序性坏死（programmed necrosis）的概念，即这种细胞膜破裂的死亡过程，也受到细胞内特异基因的控制。程序性坏死可由不同信号触发，再由细胞内不同的信号分子介导：TNF（tumor necrosis factor）诱导的典型的程序性坏死和细胞焦亡（pyroptosis）。程序性坏死可能在机体免疫反应中发挥重要作用。

3. 植物细胞的程序性死亡

细胞程序性死亡在植物中也广泛存在，但其方式与动物细胞差别较大。植物中没有类似动物巨噬细胞的可移动细胞来清除死亡残余物，因此植物细胞往往利用溶酶体（液泡）中的水解酶来消化分解死亡细胞，主要包括两种方式：（1）植物细胞内液泡膜破裂，水解酶释放出来消化细胞内含物，整个细胞被迅速直接地分解而死亡（一般发生在植物发育进程中）；（2）液泡膜与细胞膜发生融合，水解酶释放到细胞外触发细胞死亡（植物被细胞外复制的病原体感染时诱发）。

植物细胞程序性死亡的主要生理功能包括：（1）植物防御病原体的反应或称超敏反应（hypersensitive response, HR）。植物在病原体侵染部位发生细胞程序性死亡，阻止病原体侵染其他部位；（2）植物对环境胁迫的反应；（3）在植物发育进程中发挥作用。

（三）细胞凋亡的过程及其分子机制

1. 细胞凋亡的过程

形态学上，典型动物细胞凋亡过程可分为3个阶段：（1）凋亡的起始。细胞表面的特化结构消失，细胞间连接消失，，细胞质中核糖体逐渐与内质网脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；细胞核内染色质固缩凝集，形成新月形帽状结构，沿着核膜分布。（2）凋亡小体的形成。核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体等聚集在一起，被反折的细胞质膜包裹，形成膜包裹的球形结构，称为凋亡小体。（3）凋亡小体被吞噬。凋亡小体逐渐被邻近细胞或巨噬细胞吞噬，在溶酶体内被消化分解。细胞凋亡过程中细胞内含物始终被膜包裹，不泄漏到细胞外，因此不会引发机体的炎症反应。

分子水平上，细胞凋亡过程包括接受凋亡信号，凋亡相关分子的活化，凋亡的执行，凋亡细胞的清除4个阶段。大部分凋亡过程依赖于caspase蛋白酶家族成员的活性，也称为caspase依赖性凋亡（caspase dependent apoptosis）。

2. caspase 及其基本类型简介

caspase 是一组天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶，存在于细胞质中。它们的活性位点均包含半胱氨酸残基，能够特异地切割靶蛋白天冬氨酸残基后的肽键，切割的结果是使靶蛋白活化或失活，而非完全降解。

caspase 的发现源于秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）发育的研究。线虫从胚胎发育到成体的过程中共产生1090 个体细胞，其中131 个体细胞发生凋亡后消失。ced3和ced4是线虫发育过程中细胞凋亡的必需基因，ced9基因的功能是抑制细胞凋亡。线虫凋亡基因的发现促进了哺乳动物细胞凋亡机制的研究。

胎生哺乳动物caspase 家族成员有十余种，按照功能可以分为两大类：（1）炎症caspase，包括caspase-1, -4, -5, -11, -12，负责产生有活性的白介素-1（interleukin-1, IL-1）；（2）凋亡caspase，包括caspase-2, -3, -6, -7, -8, -9, -10，负责介导细胞凋亡。按照在凋亡过程中发挥的不同功能，凋亡caspase 又可分为两类：起始caspases（caspase-2，-8，-9，-10）和效应caspases（caspase-3，-6，-7）。起始酶负责对效应酶的前体进行切割，产生有活性的效应caspase；效应酶（负责切割细胞核内、细胞质中的结构蛋白和调节蛋白，使其失活或活化，保证凋亡程序的正常进行。近年的证据显示caspase 家族成员还参与了细胞自噬、坏死、分化等生命活动的调控。

3. caspase 在细胞凋亡中的作用机制

起始caspase 或效应caspase通常均以无活性的酶原形式存在于细胞质中。接受凋亡信号刺激后，酶原分子在特异的天冬氨酸位点被切割，产生的两段多肽形成大小两个亚基，再聚合成异二聚体，即具有活性的酶。

起始caspase活化属于同源活化（homo-activation），即同一种酶原分子彼此结合或与接头蛋白结合形成复合物，在复合物中构象改变被活化，进而彼此切割产生有活性的异二聚体。起始caspase-8和-10含有死亡效应结构域（DED），而caspase-2和-9则含有募集结构与（CARD）。效应caspases 的活化属于异源活化（hetero-activation），即已活化的起始caspases 招募效应 caspases 酶原分子后，对其进行切割，产生活性的效应 caspases。效应caspases 负责切割细胞中的结构蛋白和调节蛋白，使其失活或活化，此时细胞进入凋亡的执行阶段。

目前已知的效应caspase底物可分为被活化和被失活两大类。被活化的代表分子是caspase 激活的DNA 内切酶CAD（caspase activated DNase）。CAD 一般与其抑制因子ICAD（inhibitor ofCAD）结合在一起，处于失活状态。细胞启动凋亡程序后，活化的caspase-3 降解ICAD，使有活性的CAD 释放出来，在核小体间切割DNA，形成间隔200 bp 的DNA 片段。因此提取凋亡细胞的DNA 进行琼脂糖凝胶电泳时会观察到DNA梯状条带（DNAladder），这是细胞凋亡的标志之一。被失活的重要分子如聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶［poly（ADP-ribose）polymerase, PARP］。PARP能够识别损伤的DNA，使组蛋白发生ADP- 核糖基化，从DNA 上脱离下来，有助于修复蛋白与DNA 结合进行损伤修复，因此被认为是DNA 损伤的感受器。在凋亡过程中PARP 被caspase 切割后失活，使细胞对DNA的降解不再敏感。效应caspase 还通过切割细胞骨架蛋白使细胞的骨架体系发生结构变化，便于细胞改变形态以及形成凋亡小体等。此外，黏着斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）被效应caspase切割失活导致凋亡细胞与胞外基质以及其它细胞解离。

4. 细胞凋亡信号通路

凋亡途径可分为caspases依赖性细胞凋亡和caspases非依赖性细胞凋亡。当细胞受到凋亡信号的刺激时，这两条途径一般能同时被激活。

凋亡细胞表面具有引发吞噬作用的信号分子，如磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）。它一般存在于正常细胞膜脂双层的内叶，细胞发生凋亡时外翻定位到脂双层外叶，向吞噬细胞发出“吃掉我”的信号，凋亡小体可迅速被周围细胞或专职吞噬细胞识别并吞噬。磷脂酰丝氨酸的细胞表面定位也是凋亡的标志之一。

（1）caspases 依赖性细胞凋亡（caspase dependent apoptosis）

细胞内外的凋亡信号主要通过两条通路诱导caspase 活化，引发细胞凋亡：即由死亡受体引发的外源途径和由线粒体引发的内源途径。细胞凋亡的外源途径和内源途径彼此关联。

l  死亡受体引发的外源途径

死亡受体引发的凋亡起始于死亡配体与受体的结合。死亡受体的胞质部分均含有死亡结构域（death domain，DD），负责招募凋亡信号通路中的接头蛋白。Fas 是死亡受体家族中的代表成员。配体Fas L与之结合后引起Fas 的聚合，聚合的Fas 通过胞质区的死亡结构域招募接头蛋白FADD 和caspase-8 酶原，形成死亡诱导信号复合物（death inducingsignaling complex，DISC）。起始caspase-8酶原通在复合物中通过自身切割（同源活化）而被激活，进而切割效应caspase：caspase-3 酶原， 产生有活性的caspase-3，导致细胞凋亡。另一方面，活化的caspase-8还通过切割信号分子Bid 将凋亡信号传递到线粒体，引发凋亡的内源途径，使凋亡信号进一步扩大。

l  线粒体引发的内源途径

当细胞受到内部凋亡信号（如不可修复的DNA 损伤）刺激时，线粒体膜通透性会发生改变，向细胞质中释放出凋亡相关因子，引发细胞凋亡。线粒体释放到胞质中的凋亡因子有多种，其中最“著名”的是细胞色素c。释放到胞质中的Cyt c与Apaf-1结合，形成凋亡复合体（apoptosome），复合体中的Apaf-1 再通过CARD 结构域招募细胞质中的caspase-9 酶原，使其发生同源活化，活化的caspase-9 再进一步切割并激活caspase-3 和caspase-7 酶原，引发细胞凋亡。

细胞色素c 的释放源于线粒体膜通透性的改变，主要受到Bcl-2（the B-cell lymphoma gene 2）蛋白家族的调控。Bcl-2蛋白家族大多数定位在线粒体外膜上或受信号刺激后转移到线粒体外膜上，。Bcl-2家族成员可以通过彼此间的聚合及解聚来调节线粒体的通透性。Bcl-2蛋白家族含有一个或多个BH（Bcl-2 homology）结构域，BH1，BH2，BH3和BH4。Bcl-2 家族成员按照功能可分为3 个亚族：Bcl-2 亚族，包括Bcl-2，Bcl-XL， Bcl-w，Mcl-1 等，大多具有 4 个BH 结构域BH1-4，对细胞凋亡发挥抑制作用；Bax亚族，包括Bax，Bak，Bok，它们具有3 个BH 结构域BH1～3，作用与Bcl-2 亚家族的作用相反，可促进细胞凋亡；BH3 亚族，包括Bad，Bid，Bik，Puma， Noxa 等，它们仅有BH3 结构域，能够充当细胞内凋亡信号的“感受器”，作用也是促进细胞凋亡。

（3）caspases非依赖性细胞凋亡（caspase independentapoptosis）

线粒体除了释放Cyt c外，还能向细胞质内释放多个凋亡相关因子，如：凋亡诱导因子（apoptosisinducing factor，AIF）、限制性内切核酸酶 G（endonuclease G）等，它们从线粒体中释放出来进入细胞核，对核DNA 进行切割，引发caspases 非依赖的细胞凋亡。

（5） 内质网应激（ER stress，ERS）引发的细胞凋亡途径

ERS介导的细胞凋亡是近些年提出的一种新的途径（参见教材第5章）。

5. 生死抉择：细胞凋亡的调控

大多数细胞都需要获得存活信号来维持生存，这类信号主要来自于其它细胞分泌的细胞因子，包括多种有丝分裂原和生长因子。如果细胞接受不到足够的存活信号，就会激活自杀程序，引发细胞凋亡，这种依赖性保证了细胞仅生存于适当的时间和地点。

作为细胞凋亡的核心分子，caspase本身的活性在细胞中也受到严格调控，以保证在必需的情况下凋亡程序才能启动。线粒体获得的促凋亡信号往往来自于细胞内的转录因子p53。p53是重要的肿瘤抑制基因和促凋亡因子。p53 不仅可通过激活凋亡正调节因子的转录来促进凋亡，还能够抑制抗凋亡因子的转录。

哺乳动物细胞中抗凋亡和促凋亡的调控因子多种多样，因此细胞的命运——生存或者死亡，可能取决于细胞中这两类调控因子的相对含量以及胞外信号对它们进行活性调控的综合效应。

（四）细胞程序性坏死的分子机制

TNF和某些病原体诱导的细胞程序性坏死（necroptosis）分子机制：蛋白激酶RIPK3及其上游信号分子聚合形成坏死复合物（necrosome），RIPK3在复合物中发生磷酸化而活化，进而招募并磷酸化下游分子MLKL，磷酸化的MLKL寡聚化，与质膜中磷脂酰肌醇磷酸PIP结合，在细胞质膜上形成通道，导致细胞膜屏障消失，细胞坏死。

伴随炎性因子大量释放的程序性坏死——细胞焦亡（pyroptosis）分子机制：主要通过炎性小体介导包含Caspase-1在内的多种Caspase激活，使包括GSDMD在内的多种Gasdermin家族成员发生剪切和多聚化，造成细胞质膜穿孔，进而引起细胞死亡。

（五）植物细胞程序性死亡的分子机制

现有植物基因组中未发现动物caspase的同家族成员，但植物有一类蛋白酶称为metacaspase，在植物细胞程序性死亡信号途径中发挥作用。植物metacaspase的酶活性中心也含有半胱氨酸残基，但切割的是精氨酸或赖氨酸形成的肽键。

单细胞生物如细菌和酵母也存在程序性死亡。越来越多的实验证据表明，细胞程序性死亡机制在细胞生命的演化过程中具有共同的起源。而不同物种研究体系的建立，将有助于揭示各种程序性死亡途径之间的复杂关系。