一、 生产用动物细胞的要求

什么样的细胞可以允许用以生产人用的药品，这是一个一直引起人们争论的热点。随着科学的发展，特别是分子生物学，基因工程的大量实践已经否定了这种假想。如在基因重组的试验中已证明，即使在人为地加有促进剂的条件下，体外重组成功的机率也只有10-6，而在没有促进剂时则低于10-9。在体内，由于存在着大量细胞外核酸酶，因此外来的核酸更难被整合。

二、生产用动物细胞的获得

    正如上述，用于生产的动物细胞不外乎上述3类，即原代细胞、已建立的二倍体细胞系、可无限期传代的转化细胞系（continuous cell line），；以及用这些细胞进行融合和重组的工程细胞系（genetically-engineered cell line）。

1．原代细胞

2．二倍体细胞系

3．转化细胞系

4．融合细胞系

 （1）仙台病毒融合法

 （2）聚乙二醇融合法

 （3）电融合法

5．重组工程细胞系

三、基因工程细胞的构建和筛选

当前被用以构建工程细胞的动物细胞有BHK-21、C127、CHO-K1、COS、MDCK、Namalwa、Sf-9、Vero和多种骨髓瘤细胞（包括J558L，NSO和SP2/0等）。

1．真核细胞基因表达载体的构建

为了要将外源基因在动物细胞中高效表达，首先要将其构建在一个高效表达载体内。目前一般使用的载体有两类，一类是病毒载体，如牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒和杆状病毒等。牛痘病毒已被广泛地用来构建成多价疫苗，腺病毒和逆转录病毒载体正被试用于基因治疗中，而杆状病毒载体—昆虫细胞系统已被成功地用于300多种外源基因的高效表达。

2．基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选

    载体构建后，如何导入动物细胞呢？目前的方法大致可分为4类，其中使用最普遍的是磷酸钙沉淀法和电穿孔法。

 

表1 DNA导入动物细胞的常用方法

融合法	化学法	物理法	病毒法
细胞融合法	DNA—磷酸钙沉淀法	电穿孔法	重组逆转录病毒介导法
脂质体介导法	DEAE—葡聚糖法	显微注射法	重组DNA病毒介导法
原生质融合法	染色体介导法	基因枪法	多瘤病毒样颗粒介导法
微细胞介导法
鬼影红细胞介导法

    

四、常用生产用细胞的特性

    为了便于在生产过程中选择使用，并进行定期的鉴定，现将已被用于重组的一些细胞株的来源、特性、培养要求及其使用情况等作一简单介绍。更多的材料可参阅Hey等编写的目录。

 1．BHK-21细胞

 2．C127细胞

 3．CHO-K1细胞

 4．COS细胞

 5．MDCK细胞

 6．MRC-5细胞

 7．Namalwa细胞

 8．Sf-9细胞

 9．Vero 细胞

 10．WI-38细胞

11．鼠骨髓瘤细胞

五、 细胞库的建立

    除原代细胞外，其他的细胞株、细胞系，无论是二倍体细胞、转化细胞、还是融合细胞或经重组的工程细胞，一旦建立后都需建细胞库加以保存。按我国和美国FDA的规定，用于生产的工程细胞必需建立两个细胞库：原始细胞库（master cell bank，MCB）和生产用细胞库（manufacturer’s working cell bank, MWCB）或称工作细胞库（ working cell bank, WCB）。

    储存于MCB的细胞应该是单一来源的均质的细胞，对于二倍体细胞应该是群体倍增水平（population doubling level）尽可能低的细胞。

    细胞库的建立和保管是用以进行药品生产的基础，所以必须高度负责。为确保其安全，除了必须制定一系列严格的管理制度外，最好将细胞库分两处保存。以防发生事故如液氮罐泄漏、着火等时，不致全部丢失。

一、单项选择题

1. DNA导入动物细胞的常用方法中，融合法不包括______。
A.细胞融合法
B.脂质体介导法
C.鬼影红细胞介导法
D.染色体介导法
【答案】 D

二、多项选择题

1. DNA导入动物细胞的常用方法包括______。
A.DEAE—葡聚糖法
B.显微注射法
C.重组DNA病毒介导法
D.原生质融合法
【答案】 ABCD

2. DNA导入动物细胞的常用方法中，病毒法包括_______。
A.重组逆转录病毒介导法
B.重组DNA病毒介导法
C.多瘤病毒样颗粒介导法
D.染色体介导法
【答案】 ABC