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1 内容
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2 测验14.4
一、教学目标
1.掌握DNA的复制过程以及参与DNA复制的一些酶和蛋白质；
2.真核生物与原核生物DNA复制的主要差异；
3.逆转录的过程及其生物学意义。
二、教学重点
1. DNA合成的两条途径；
2. DNA的损伤和修复。
三、教学难点
比较分析DNA复制与逆转录的异同
RNA指导的DNA合成（逆转录）
逆转录（reverse transcription）：以RNA为模板，合成DNA。与通常转录过程中遗传信息流从DNA到RNA的方向相反。
一、逆转录酶
由一个α亚基和一个β亚基组成，含有Zn2+，具有三种酶活力。
（1）RNA指导的DNA聚合酶活力（以RNA为模板，合成一条互补的DNA，形成RNA—DNA杂种分子）。
（2）RNase H酶活力，水解RNA—DNA杂种分子中的RNA，可沿3’→5’和5’→3’两个方向起外切酶作用。
（3）DNA指导的DNA聚合酶活力。
模板：RNA或DNA
以自身病毒类型的RNA为模板时，该酶的反转录活力最大，但是带有适当引物的任何种类的RNA都能作为合成DNA的模板。
引物：RNA或DNA
底物：dNTP
二价阳离子：Mg2+或Mn2+
真核mRNA3’端有polyA，加入oligo dT后，可以作为反转录酶的模板，合成cDNA。
二、cDNA合成
1、cDNA文库的构建
cDNA：以mRNA为模板，用反转录酶合成第一链，去除mRNA，合成的第二链。
cDNA文库是获得真核结构基因的最好方法，成熟的mRNA无内含子。
（1）真核mRNA的分离纯化
特点：含量少，不均一，表达具有发育阶段性和组织特异性。
总RNA： rRNA 80~85%
mRNA 1~5%
tRNA及其它小分子RNA 10~15%
不均一：在1~5%的mRNA中，有10000—30000种mRNA。
分离、纯化：
（2）cDNA合成（逆转录酶）
A. 自身引物法（S1核酸酶降解法）
Oligo(dT)15-18个核苷酸
mRNA5’端序列有丢失。
B. 取代合成法（较常用）
Oliyo（dT）与mRNA3’端AAA杂交作为引物，合成第一条DNA链。
RNaseH在mRNA上产生多个切口。
DNA pol.Ⅰ切口平移，DNA ligase连接，合成出第二条DNA链。
T4DNA pol.切去端头的RNA-DNA杂交链。
C. 引物合成法
可以合成全长cDNA，mRNA的5’端不丢失。
（3）cDNA与载体连接
（4）重组体的转化
（5）扩增、保存
2、获取特定mRNA的cDNA
（1）免疫法分离特定的mRNA
（2）PCR法
