一、教学目标
1.学习并掌握RNA生物合成的过程；
2.比较真核生物和原核生物转录的主要区别。
二、教学重点
转录与RNA的复制
三、教学难点
1.转录
2.RNA复制
DNA指导的RNA合成（转录）
RNA链的转录，起始于DNA模板的一个特定位点，并在另一位点终止，此转录区域称为一个转录单位。一个转录单位可以是一个基因（真核），也可以是多个基因（原核）。
基因的转录是有选择性的，细胞不同生长发育阶段和细胞环境条件的改变，将转录不同的基因。
转录的起始由DNA上的启动子区控制，转录的终止由DNA上的终止子控制，转录是通过DNA指导的RNA聚合酶来实现的。
一、RNA聚合酶
RNA合成的基本特征
①底物：NTP（ATP、GTP、CTP、UTP）
②RNA链生长方向：5’→3’
③不需引物
④需DNA模板
1、E.coli RNA聚合酶（原核）
E.coli和其它原核细胞一样，只有一种RNA聚合酶，合成各种RNA（mRNA、tRNA、rRNA）。
一个E.coli细胞中约有7000个RNA聚合酶分子，在任一时刻，大部分聚合酶（5000左右）正在参与RNA的合成，具体数量依生长条件而定。
E.coli RNA聚合酶全酶|（holoenzyme）分子量46万Da，由六个亚基组成，α2ββ’ σω，另有两个Zn2+。
σ亚基的功能：核心酶在DNA上滑动，σ亚基能增加酶与DNA启动子的结合常数，增加停留时间，使聚合酶迅速找到启动子并与之结合，σ亚基本身无催化活性。
不同的σ因子识别不同的启动子，从而表达不同的基因。
不同的原核生物，都具有相同的核心酶，但σ亚基有所差别，这决定了原核基因表达的选择性。
RNA聚合酶的催化活性：RNA聚合酶以完整的双链DNA为模板，转录时DNA的双链结构部分解开，转录后DNA仍然保持双链的结构。
核心酶覆盖60bp的DNA区域，其中解链部分17bp左右，RNA-DNA杂合链约12bp。
纯的RNA聚合酶，在离体条件下可转录双链DNA，但在体内，DNA的两条链中只有一条可用于转录，这可能是由于RNA聚合酶在分离时丢失了σ亚基引起的。
解旋和重新螺旋化也是RNA聚合酶的内在特性，在酶的前端解螺旋，在后端以相反方向重新螺旋化，活体状况中，可能还有其它酶活性来帮助调整DNA的拓扑学性质。
2、真核生物RNA聚合酶
真核生物的转录机制要复杂得多，有三种细胞核内的RNA聚合酶：RNA聚合酶I转录rRNA，RNA聚合酶II转录mRNA，RNA聚合酶III转录tRNA和其它小分子RNA。这三种RNA聚合酶分子量都在50万左右，亚基数分别为6-15。
动物、植物、昆虫等不同来源的细胞，RNApolⅡ的活性都可被低浓度的α-鹅膏蕈碱抑制，而RNApolⅠ不受抑制。
动物RNApolⅢ受高浓度的α-鹅膏蕈碱抑制，而酵母、昆虫的RNApolⅢ不受抑制。
除了细胞核RNA聚合酶外，还分离到线粒体和叶绿体RNA聚合酶，它们的结构简单，能转录所有种类的RNA，类似于细菌RNA聚合酶。
二、RNA聚合酶催化的转录过程（E.coli）
1、起始
RNA聚合酶结合到DNA双链的特定部位，局部解开双螺旋，第一个核苷酸掺入转录起始位点，从此开始RNA链的延伸。
在新合成的RNA链的5’末端，通常为带有三个磷酸基团的鸟苷或腺苷（pppG或pppA），即合成的第一个底物是GTP或ATP。
起始过程中，σ因子起关键作用，它能使聚合酶迅速地与DNA的启动子结合，σ亚基与β’结合时，β’亚基的构象有利于核心酶与启动子紧密结合，。
正链：与mRNA序列相同的两、链。
负链：模板链。
转录起点是+1，上游是-1。
2、延长
转录起始后，σ亚基释放，离开核心酶，使核心酶的β’亚基构象变化，与DNA模板亲和力下降，在DNA上移动速度加快，使RNA链不断延长。
转录起始后，σ亚基便从全酶中解离出来，然后nusA亚基结合到核心酶上，由nusA亚基识别序列序列。
3、终止
RNA聚合酶到达转录终止点时，在终止辅助因子的帮助下，聚合反应停止，RNA链和聚合酶脱离DNA模板链，nusA又被σ亚基所取代。。
由此形成RNA聚合酶起始复合物与终止复合物两种形式的循环。
三、启动子和转录因子
启动子：RNA聚合酶识别、结合并开始转录所必需的一段DNA序列。
转录因子：RNA聚合酶在进行转录时，常需要一些辅助因子（蛋白质）参与作用，此类蛋白质统称为转录因子。
（一）原核启动子结构与功能
分析比较上百种启动子序列，发现不同的启动子都存在保守的共同序列，包括RNA聚合酶识别位点和结合位点。
1、-10序列（Pribnow框）
在转录起点上游大约-10处，有一个6bp的保守序列TATAAT，称Pribnow框。此段序列出现在-4到-13bp之间，每个位点的保守性在45%-100%。
1、-35序列（Sexfama box）（识别区域）
只含-10序列的DNA不能转录，在-10序列上游还有一个保守序列，其中心约在-35位置，称为-35序列，此序列为RNA酶的识别区域。
-35序列的功能：在很大程度上决定了启动子的强度，RNA聚合酶易识别强的启动子。
-35序列提供RNA聚合酶识别信号，
-10序列有助于DNA局部双链解开，
启动子结构的不对称性决定了转录的方向。
（二）真核启动子
真核基因的转录十分复杂，对启动子的分析要比原核基因的困难得多。
真核生物有三种RNA聚合酶：RNA聚合酶I、II、III，分别转录rRNA、mRNA、tRNA和小分子RNA，这三类聚合酶的启动子各有其结构特点。
1、RNA聚合酶Ⅱ的启动子
RNA聚合酶Ⅱ的启动子有三个保守区：
（1）、TATA框（Hogness框）
中心在-25至-30，长度7bp左右。
此序列功能：使DNA双链解开，并决定转录的起点位置，失去TATA框，转录将可能在许多位点上开始。
（2）、CAAT框
中心在-75处，9bp，共有序列GGT（G）CAATCT
功能：与RNA聚合酶结合。
（3）GC框
在CAAT框上游，序列GGGCGG，与某些转录因子结合。
CAAT和GC框均为上游序列，对转录的起始频率有较大影响。
2、RNApolⅢ的启动子
RNApolⅢ的启动子在转录区内部。
四、终止子和终止因子
终止子：提供转录终止信号的一段DNA序列。
终止因子：协助RNA聚合酶识别终止子的蛋白质辅助因子。
有些终止子的作用可被特异的因子所阻止，使酶越过终止子继续转录，称为通读，这类引起抗终止作用的蛋白质称为抗终止因子。
终止子位于已转录的序列中，DNA的终止子可被RNA聚合酶本身或其辅助因子识别。
五、转录过程的调节控制
基因的表达是受到严格的调节控制的，转录水平的调控是关键的环节，转录调控主要发生在起始和终止阶段。
时序调控：生长、发育、分化、时间程序。
适应调控：细胞内外环境改变。可位于基因的上游或下游区或内含子中。
操纵子：原核生物基因表达的协调单位，包括结构基因、调节基因及由调节基因产物所识别的控制序列（启动子、操纵基因）。
增强子：真核生物、病毒的基因组内，对转录起增强作用的一段DNA序列。它具有长距离效应，与方向无关，只作用于同一条DNA链上的启动子。
转录水平的调控取决于调节因子（RNA或蛋白质）与启动子、增强子、终止子之间的相互作用。
RNA转录后的加工
RNA聚合酶合成的原初转录产物，要经过剪切、修饰、拼接等过程，才能转变成成熟的RNA分子，此过程称RNA转录后的加工。
一、原核生物RNA的加工
在原核生物中，rRNA基因与某些tRNA基因组成混合操纵子，可提高效率、节省空间（增加有效信息）。其它的tRNA基因也成簇存在，并与编码蛋白质的基因组成操纵子，它们在形式多顺反子转录物后，断裂成为rRNA和tRNA的前体，然后进一步加工成熟。
1、原核rRNA前体的加工（E.coli）
E.coli共有三种rRNA
5S rRNA 120b
16S rRNA 1541b
23S rRNA 2904b
rRNA原初转录物含6300个核苷酸，约30S。
大肠杆菌有7个rRNA的转录单位（操纵子），它们分散在基因组的各处。每个转录单位由16SrRNA、23SrRNA、5SrRNSA以及一个或几个tRNA基因所组成。每个操纵子中tRNA基因的种类、数量和位置都各不相同。
RNAaseⅢ是一种rRNA、多顺反子mRNA加工的内切酶，识别特定的RNA双螺旋区。
RNAase E也可识别P5（5SrRNA前体）两端形成的双螺旋区。
2、原核tRNA前体的加工
E.coli染色体基因组有60个tRNA基因，即某种a.a.的tRNA基因不止一个拷贝。
tRNA基因大多成簇存在，或与rRNA基因，或与蛋白质基因组成混合转录单位。
tRNA前体加工步骤
a. 核酸内切酶(RNAaseP、RNAaseF)在tRNA两端切断。
b. 核酸外切酶(RNAaseD)从3’端逐个切去附加序列。
c. 在tRNA3’端加上-CCA-OH。tRNA核苷酰转移酶
d. 核苷的修饰（修饰酶）：甲基化酶 / S-腺苷蛋氨酸（SAM），假尿苷合成酶。
3、原核mRNA前体的加工
由单顺反子构成mRNA，一般不需加工，一经转录，即可直接进行翻译。有些多顺反子构成的mRNA，须由核酸内切酶切成较小的mRNA，然后再进行翻译。
二、真核生物RNA的加工
真核rRNA、tRNA前体的加工过程与原核的很相似，但mRNA的加工过程与原核的有很大不同。
1、真核rRNA前体的加工
真核生物核糖体的小亚基含：16-18S rRNA，大亚基含：26-28S r RNA、5S rRNA、5.8S rRNA（特有）。
真核生物的核仁是rRNA合成、加工和装配成核糖体的场所，大、小亚基分别组装后，通过核孔转移到胞质中参与核糖体循环。
2、真核tRNA前体的加工
真核tRNA基因的数目比原核tRNA的要多的多。例如，E.coli有60个tRNA基因，啤酒酵母250个，果蝇850个，爪蟾1150个，人1300个。
真核tRNA基因也成簇排列，被间隔区分开，tRNA基因由RNA聚合酶Ⅲ转录。
真核tRNA前体的剪切、修饰过程与原核相似。
3、真核生物mRNA前体的加工
mRNA原初转录物是分子量很大的前体，在核内加工过程中形成分子大小不等的中间产物，它们被称为核内不均一RNA（hn RNA）。其中，约有25%可转变成成熟的mRNA。
hnRNA半寿期很短，比细胞质中的mRNA更不稳定，一般在几分钟至1小时。而细胞质mRNA的半寿期为1-10小时，神经细胞mRNA最长可达数年。
hnRNA转变成mRNA的加工过程主要包括：
a. 5’末端形成帽子结构
b. 3’末端切断并加上polyA
c. 剪接除去内含子对应的序列
d. 甲基化
（1）5’末端加帽
RNA三磷酸酶，mRNA鸟苷酰转移酶，mRNA（鸟嘌呤-7）甲基转移酶，mRNA（核苷-2’）甲基转移酶。
由于甲基化的程度不同，有三种类型的帽子：CAP O型，CAP I型，CAP II型。
★5’帽子也出现于hnRNA，说明加帽过程可能在转录的早期阶段或转录终止前就已完成。
★5’帽子的功能
a. 在翻译过程中起信号识别作用，协助核糖体与mRNA结合，使翻译从AUG开始。
b. 保护mRNA，避免5’端受核酸外切酶的降解。
（2）3’端加polyA
hnRNA链由RNAaseⅢ切断，由多聚腺苷酸聚合酶催化，加上polyA，ATP为供体。
加尾信号：AATAAA、YGTGTGYY（Y为嘧啶）。
高等真核生物和病毒的mRNA在靠近3’端区都有一段非常保守的序列AAUAAA，这一序列离多聚腺苷酸加入位点的距离在11-30nt范围之内。
核内hnRNA的3’端也有多聚腺苷酸，表明加尾过程早在核内已经完成。hnRNA中的poly（A）比mRNA略长，平均150-200nt。
polyA的功能
a. 防止核酸外切酶对mRNA信息序列的降解，起缓冲作用。
b. 与mRNA从细胞核转移到细胞质有关。
3’脱氧腺苷（既冬虫夏草素）是多聚腺苷酸化的特异抑制剂，但它不抑制hnRNA的转录。
（3）mRNA甲基化
某些真核mRNA内部有甲基化的位点，主要是在N6-甲基腺嘌呤（m6A）。
三、RNA的拼接和催化作用（内含子的切除）
多数真核基因是断裂基因，其转录产物通过拼接，去除内含子，使编码区（外显子）成为连续序列。
有些内含子可以催化自身的拼接（self-splicing）,有些内含子需要在有关酶的作用下才能拼接。
四、RNA的催化功能
1、I类内含子的自我剪接（顺式剪接）
I类内含子包括四膜虫rRNA的内含子，几种酵母线粒体的内含子，噬菌体T4胸苷酸合成酶的内含子等。这些内含子有较大的同源性，可自我拼接。
1981，Cech（美国），四膜虫rRNA前体（约6400nt）能自动切除413个nt的内含子，然后加工生成5.8S、17S、26S rRNA。
1984，Apirion（美国），噬菌体T4的RNA可以在没有蛋白质参与下自我断裂，由215nt前体链切下76nt 。
2、独具催化活性的小分子RNA
1984，Altman，Pace（美国），细菌加工tRNA前体的酶—RNAase P中的M1RNA（375nt）在高浓度的Mg2+或胺类存在时能单独切下tRNA前体的5’端。
1，4-α葡聚糖分支酶中的RNA（31nt）也单独具有分支酶活力。
真核的U-snRNA催化rRNA前体、hnRNA前体的加工。
RNA的复制
有些RNA病毒，进入寄主细胞后，借助复制酶而进行RNA病毒的复制。
从感染RNA病毒的细胞中可以分离出RNA复制酶，这些RNA复制酶的模板特异性很强，只识别病毒自身的RNA，它以病毒RNA为模板，合成与模板性质相同的RNA。
病毒RNA复制的主要方式
1、正链RNA病毒（mRNA）：噬菌体Qβ、灰质炎病毒等。
进入寄主细胞后，利用寄主的翻译系统，首先合成复制酶及有关的蛋白质，然后进行病毒RNA的复制，最后由病毒RNA和蛋白质装配成病毒颗粒。
2、负链RNA病毒（带有复制酶）：狂犬病毒等
此类病毒带有复制酶，侵入后，复制酶首先合成出正链RNA（mRNA），再以正链RNA为模板，合成负链RNA及蛋白质，然后装配。
3、双链RNA病毒（带有复制酶）：呼肠孤病毒等
以双链RNA为模板，在复制酶作用下先转录正链RNA（mRNA），从而翻译出蛋白质，然后合成负链RNA，形成双链RNA，再包装。
4、逆转录病毒（含逆转录酶）：白血病病毒、肉瘤病毒等致癌RNA病毒
正链RNA病毒，它们的复制需要经过DNA前病毒阶段。
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