第31课时  分子育种的理论与实践

一、分子育种的理论基础（理解）

  分子育种：主要应用现代分子生物学理论与方法，结合传统育种技术，在分子水平上培育新品种的过程，包括分子标记辅助育种和遗传修饰育种或转基因育种等。

  分子育种相关的理论基础如下：

  1.性状和性状的遗传基础

  ①质量性状；

  ②数量性状；

  ③阈性状：表型呈非连续变异，而遗传物质的数量呈潜在的连续变异的性状，即只有超越某一遗传阈值时才出现的性状，如动植物甚至包括人类的抗病力、死亡率以及单胎动物的产仔数等性状。

  阈性状不完全等同于数量性状或质量性状，他们具有一定的生物学意义或经济价值，其与质量性状类似，但是又不服从孟德尔遗传定律。一般认为这类性状具有一个潜在的连续型变量分布，其遗传基础是多基因控制的，与数量性状类似。因为它受基因制约，所以它有一个潜在的连续分布，但它的表现却受阈值控制。阈性状有的只有一个阈值，表现只有两个变异类型，如抗病力的发病与健康；有的有两个阈值，表现出三种变异类型，如绵羊的单羔、双羔和多羔；有的也可能有三阈、四阈……。但阈值过多的性状不宜作为阈性状处理，如猪的产仔数、鸡的产蛋数，虽然严格说来也不呈连续变异，但因阈值较多，其表现分布可近似地当作连续分布来处理。所以一般作为阈性状进行研究的都是少于三阈的阈性状。

   阈性状不是数量遗传学研究的理想对象，对它的分析需要作一些勉强的假定，而且不很精确。所以最好能找到与其意义相近的连续变异性状，进行典型的数量遗传分析和选择，效果会更好一些。例如，对抗病力，不只作死亡和存活的阈性状分析和选择，而以感染后存活时间作指标来进行数量性状分析和选择，或者寻找一个与其相关密切的数量性状作辅助性状，进行间接选择。

  2.分子育种的理论基础

  鱼类分子育种是指在群体、家系或个体选择中使用基因或分子标记并最终形成品种（品系）的育种技术。

  途径：富集目的基因+控制近亲交配；

  目的：获得在所选性状上基因型纯合而其他很多基因座是杂合的并趋向纯合位点与杂合位点的平衡，使优良性状得以长期保持的品种。

  分子育种技术的核心要素：

  ①性状相关的优势基因（型）或标记的富集是获得优良性状的遗传基础；

  ②表型选择是获得好的经济性状的必要途径，优良表型是检验育种效果的最终指标；

  ③避免近亲繁殖是建立优良品种和进一步保护品种优良性状的技术保证；

  ④基因标记与综合性状的指数评估是提高选择强度的重要环节；

  ⑤基因与标记的作用不是一成不变的，在不同的群体和选育世代中均会发生变化。

  3.分子育种的基本概念及技术特征

  分子育种主要应用现代分子生物学的理论和方法，结合传统选育技术培育新品种。

  分子育种技术根据个体、群体或家系的分子遗传组成来选择亲本，根据优势性状基因或标记的基因型聚合情况进行选择，这些选择手段是以特定物种的分子遗传学研究深度为基础的，使用基因或分子标记，能较大幅度地提高选育强度和选择效率。

  基于经济性状相关基因和标记的育种技术分类：

  ①基于单基因座与性状紧密连锁的单个基因型作为选择手段的育种技术；

  ②基于几个基因座与单个性状紧密连锁的几个基因型作为选择手段的育种技术；

  ③基于多个基因座与单个性状紧密连锁的多个基因型作为选择手段的以计算机计算结果为指标的分子设计育种技术；

  ④基于全基因组关联分析结果和性状多层次的信号传导分析结果的目标性状或者综合性状的多个基因型为选择手段的以计算机计算结果为指标的分子设计育种技术和全基因组选择技术；

  ⑤基于亲本间分子遗传背景与经济相关标记相结合的育种技术。

二、基于亲本遗传背景的分子育种（理解）

 目前，水产动物中常用的选育方法主要有群体选育、家系选育、分子标记辅助育种等。群体选育是生产单位进行选育常用的方法，具有快速分离出较为理想个体的优点，但该方法选育出的个体可能是杂合体，长期采用此法可能会带来种质资源分化、遗传纯度降低等问题，且大规模的群体选育会消耗大量的人力物力。家系选育是当今水产育种中培育新品种的重要方法之一，该法具有遗传背景清晰、系谱明了、选育后代纯合度高、选育效果显著等优点。然而家系选育是选择一对亲本自交产生后代，基因库会不断地减小，且家系养殖群体内规模不够大时，优良性状基因不能得到充分的表达，影响选育效果。分子标记辅助育种具有以下优点:可同时以多个基因为目标进行材料的筛选，将多个基因聚合到同一个育种材料中，使其品质得到改良；可提前对目标性状进行筛选；可反映DNA水平上的遗传变异，因此，能够在生长的各个时期进行选择，不会受到环境的影响，大大提高了目的基因选择的效率和准确性，拓宽了育种的方法和途径，然而分子标记的开发工作较为繁琐，工作量较大，且很多基因的功能尚未明确，对选育有一定的阻碍。

  （一）结合分子标记的家系选育

  1.选育方法：

  结合分子标记进行表型选择，再结合后裔鉴定、物理标记、综合指数评估和BLUP分析等进行的选育。

  2.技术路线：

  表型选择→分子标记检验与选择→家系繁育→后裔鉴定→获选家系现代物理标记→综合性状的指数评估→综合性状的BLUP分析（可选）。

  3.优点：

  ①家系选育：记录谱系、避免近亲繁殖、环境影响小；

  ②分子标记：分辨率高（亲权鉴定）；

  ③同池混养：节省劳动量和避免环境差异、降低成本、提高选择强度。

  4.步骤：

  ①亲本的选择：       

  a.外观选择：根据经验选择不可量性状；

  b.表型数据选择：Xn=X ̅±2S，S-标准差，1S 时选择强度最低；2S 时选择强度中等；3S 时选择强度最高；若加入BLUP分析效果更好，不加也可以。BLUP法剔除指数低的个体：确定亲本综合性状指数及各指数的加权值，由计算机软件完成；

   c.分子标记选择：用30个以上分子标记对入选亲本进行遗传分析；选取遗传距离在0.2-0.7（0.5-0.7之间最好）之间的个体进行配组（可选BLUP分析）。

 最佳线性无偏预测(Best Linear Unbiased Prediction, BLUP)法是一种能显著提高遗传进展，特别是对于中等程度和高遗传力性状系谱信息较健全，个体表型值较准确的性状，其效果更加明显的方法。20世纪50年代初，美国康奈尔大学学者Henderson提出；70年代以来这一方法在牛的遗传改良中得到了广泛应用，成为多数国家牛育种值估计的常规方法；80年代后期，一些国家开始把这一方法应用于猪。最佳-估计误差最小: 估计值与真实育种值相关最大；线性-估计是基于线性模型: 假设个体性能是遗传和非遗传效应的总和;无偏-估计过程中估计值是无偏的: 估计与真实育种值间平均差为零, 即所有可能估计值的平均值等于真实育种值;预测-一个体将来作为亲本的预测育种值。

  ②子代繁育：各家系F1代进行人工标记，防止混杂。

  ③优良家系的鉴定：若亲本寿命较长，可进行后裔鉴定，选择亲本；若不具备重复作为亲本的条件，则走后代选育路线，通过比较各家系性状均值，选留优良家系继续繁育选育下一代。

  ④F2亲鱼的培育：

  第一阶段，选鱼种（生长速度前10%-20%获选）；

  第二阶段，2龄鱼（生长速度前10%-20%获选）；

  第三阶段，后备亲鱼成熟阶段（生长速度前10%-20%获选）。

  ⑤后代亲鱼的循环培育和选育。

  ⑥遗传性状定型：本育种方案可以选择无限培育的技术路线，也可选择在某一世代定型，形成一个可规模化生产苗种的品种或品系。

  5.分子标记与家系选育实例：

  一种暗纹东方鲀群体—家系—分子综合遗传育种的方法

 包括如下步骤：

 a.基础亲鱼选择：从群体中挑选体格健壮、色泽好、性腺发育良好的暗纹东方鲀作为繁殖的亲鱼进行连续四代群体选育,在群体选育后出现两种性状分离明显的群体,分别是野生暗纹东方鲀及黑色暗纹东方鲀；

 b.建立家系：以野生暗纹东方鲀和黑色暗纹东方鲀作为基础选育群体,利用分子标记技术对亲本DNA进行检测,统计分析并计算出亲本个体之间的相似度和遗传距离等遗传参数,并根据个体间的遗传距离指导亲本1对1的配组繁殖,结合遗传距离以及形态特征构建了80个家系,其中分为20个黑色自交家系,40个黑色与野生正反交配对家系及20个野生型自交家系；

 c.以生产单元为基础的群体选育：将每个家系作为一个生产单元,从鱼苗到亲鱼,分别在孵化后、50日龄、210日龄、370日龄、530日龄和690日龄进行六次筛选,最终选择出存活率高、体格健壮、无外伤、色泽好、条纹清晰、活力强、性腺发育良好及生长速度快的家系作为配种亲本。在整个选育的过程中,为了减少环境条件的差异,要确保每个家系在各阶段的养殖空间的大小、水温、盐度、光照、溶氧和饵料条件保持一致,同时在不同的养殖阶段,保证各家系的养殖数量一致；

 d.第二代家系选育：亲鱼配种通过Populations软件对步骤c中选育出的配种亲本进行计算,得到雌雄个体间的遗传距离矩阵,根据雌雄个体间的遗传距离和形态特征指导上述亲本进行1对1配对繁殖,选取遗传距离排名大的雌雄个体作为待配对的亲本,建立第二代选育家系80个；取遗传距离较小的雌雄个体建立对照家系20个,人工催产授精,受精后每个家系的受精卵分别放入不同的孵化桶中分别进行孵化,孵化水温20-24℃,溶氧6mg/L以上,盐度小于1‰,孵化时间4-5天,得到第二代家系选育的鱼苗；

 e.对80组第二代选育家系和20组第二代对照组家系重复步骤b-d的选育步骤,得到第三代鱼,开展新一轮的家系选育。

 摘要：

 一种暗纹东方鲀群体—家系—分子综合遗传育种的方法,包括步骤：首先进行连续4代的群体选育,群体选育后出现了两种性状分离比较明显的群体作为下一步家系选育的基础选育群体,借助分子标记技术辅助家系的构建,每个家系亲本所产后代单独养殖,建立以家系为单元的基础群体,形成一个大的生产单元,对每个独立的生产单元进行群体选育,在三个养殖阶段、商品鱼培育阶段以及成熟前进行六次选择,下一世代的选育重复上述步骤。本发明的优点为：可以高效的选出优势亲本,与此同时利用分子标记技术进行遗传分析,可以在育种前了解亲本的遗传状况,指导亲本配对,从而达到科研与生产相结合的目的,并且有效地实现家系内优势个体的选择,兼具了优选育种与资源利用。

（二）结合分子标记的群体选育

    例子：微卫星分子标记指导镜鲤群体选育      

 论文摘要：用26个扩增效果好的微卫星分子标记分析了镜鲤(Cyprinus carpio L.)养殖亲本群体的遗传结构，指导其群体选育。共检测到153个等位基因，片段大小为108-400bp，平均等位基因数(A)5.8846个，平均有效等位基因数(Ne)2.8625个，平均观察杂合度(Ho)0.5063，平均期望杂合度(He)0.5602，平均多态信息含量(PIC)0.5292，表明该繁育群体处于较高的遗传多样性水平。用χ2检验和遗传偏离指数估计Hardy-Weinberg平衡，表明群体处于平衡状态，但在多个位点表现出杂合子缺失严重，显示出人工选择的痕迹。用PHYLIP3.6软件绘制基于Nei氏标准遗传距离的UPGMA聚类图，依据亲本个体间的遗传差异，以避免近亲交配为原则，建立最佳亲本配组体系，繁育获得2个选育群体，以常规群体繁育子代群体作为对照组，对子代群体的遗传结构及数量性状分析显示，选育群体保持了较高的遗传多样性水平，群体平均期望杂合度在0.5414-0.5449之间，其生长速度较对照群体快14.81%-63.71%。连续2年的生长实验证实，微卫星标记指导群体选育技术在保持群体的遗传多样性水平，避免近交衰退，快速建立优良种群方面具有一定的优势。

 实验材料：镜鲤亲本繁育群体采自国家级天津市换新水产良种场，亲本的选择包括外观选择、表型数据选择、分子标记选择，具体选择标准及详细实验步骤参照文献[孙效文. 鱼类分子育种学［M］.北京：海洋出版社，2010]。2006年度分析亲本 208尾：雌性106尾，雄性102尾，年龄3-4 龄，体质量4-7kg。分析亲本群体的遗传结构后，根据个体遗传关系绘制个体亲缘关系图谱，以避免近亲繁殖为目的将亲本分为两组，交叉进行繁育。第一组雌性50尾，雄性53尾；第二组雌性56尾，雄性49尾。组间雌雄交叉进行群体繁育，子一代分别编号为A组和B组，以良种场常规繁育的苗种作为对照组（C组），每组随机取鱼苗3000尾，在网箱中常规养殖，于当年9月分别由A、B、C组采鱼50尾，测量数量性状，提取基因组DNA。2007年3月从同一个亲本群体又选出191尾亲本进行了重复实验。

 实验结果：请查阅下述文献（延伸阅读）。

（三）基于基因型与性状关系分子育种

  1.富集经济性状优势基因型的育种技术：

  在同一育种群体选择与QTL定位结果一致的优势基因（基因型或等位基因）组合，使优势基因型或等位基因富集，从而使优势性状更为突出。

 日本东京海洋大学Sakamoto教授领导的鱼类遗传病理学研究室从1989年开始致力于鱼类分子标记辅助育种研究，通过构建遗传图谱、QTL定位，先后找到了与虹鳟抗传染性胰脏坏死病、传染性造血器官坏死病、显性白化病、牙鲆抗淋巴囊肿病、鰤鱼抗寄生虫感染、红点鲑渗透压耐受性、香鱼抗冷水病等相关分子标记。

   2.多个经济性状相关基因的聚合育种技术：

   鱼类的经济性状多为数量性状，在QTL分析结果中经常有几个对性状贡献接近的主效基因，将这几个主效基因的目标基因型通过分子标记技术聚合在一个个体上的技术就称为多选择聚合育种。  

  聚合育种程序图如下：

  3.基于全基因组关联分析研究结果的育种技术：

  2003年比利时科学家Peleman等提出设计育种的概念。

  基本步骤：

  ①定位所有经济性状的基因座（选最好的样本将经济性状的定位做好，作物选回交导入系等）；

  ②评价所有性状相关基因座上的等位基因的变异情况（基因组水平的单倍型与性状的相关性、鉴定出性状的主效基因的等位基因或单位型的贡献率）；

  ③根据选择性状的所有主效基因座的最佳基因型建立计算机软件来设计最佳的雌雄配组方案（多基因组合成最好的子代的基因座）。

          遗传育种技术的发展过程和趋势

复习题：

一、问答题：

1.结合分子标记的家系选育步骤如何进行？

2.请画出多个经济性状相关基因的聚合育种程序图。

二、简答题：

1.分子育种技术的核心要素有哪些？

2.基于经济性状相关基因和标记的育种技术分类有哪些？

3.在结合分子标记的家系选育中亲本是如何选择的？

4.写出结合分子标记的家系选育的技术路线。

5.在微卫星分子标记指导镜鲤群体选育的研究中亲本是如何配组的？

三、名词解释：

1.分子育种；

2.阈性状；

3.分子设计育种；

4.多选择聚合育种。