第29课时  分子遗传标记的原理

一、第一代分子标记原理（理解）

       1.RFLP分子标记：

（1）定义：以限制性片段长度多态性 (restriction fragment length polymorphism)作为分子标记，是发展最早的分子标记技术，该标记通过限制性内切酶酶切不同个体基因组DNA之后，采用Southern杂交技术获得含有与探针序列同源的酶切片段长度上的差异，进而开展多态性分析。

（2）原理：基因组DNA序列上的变化，如碱基替换、插入、缺失或重复，均会造成某种限制性内切酶（restrictionenzymes ）酶切位点的增加或丧失以及内切酶酶切位点间DNA片段的插入、缺失或重复等，从而形成序列多态性。例如：

  A、限制位点的碱基置换（Base substitution at the restriction sites）：图A；

  B、插入或删除（Insertions or deletions）：图B。

     

          Southern杂交技术路线图

   Southern印迹杂交是1975年由英国人southern创建的。Southern印迹杂交的基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris缓冲液中和和高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素膜上、烘干固定后即可用于杂交。附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射显影术确立探针互补的每一条DNA带的位置，从而可以确定在众多消化产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。

（3）优点：

  ①无表型效应（不受发育阶段、器官和基因互作影响），且数量多；

  ②共显性，可以区分杂合子和纯合子（双亲的2个以上分子质量不同的多态性片段均在F1中表现）；

  ③可以利用现有探针，具有种族特异性；

  ④遍及整个基因组；

  ⑤重复性好，稳定性高。

（4）缺点：

   ①DNA需要量大（5-30微克）；

   ②步骤繁琐、周期长；

   ③检测效率低；

   ④同位素污染；

   ⑤需要制备多个探针；

   ⑥无法分析序列未明确的目标基因。

 （5）技术路线图：

   酶切→电泳→标记探针杂交→分析。

二、第二代分子标记原理（理解）

    2.RAPD分子标记：

 （1）定义：以随机扩增多态性DNA（Random AmplificationPolymorphism DNA，RAPD）为分子标记，该标记利用人工随机合成的寡聚脱氧核苷酸为引物（通常长度为10个核苷酸），PCR扩增基因组DNA，从而获得长度不同的多态性DNA片段，进而开展多态性分析。

 （2）原理：RAPD是利用一系列不同碱基顺序的随机引物对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物（即DNA片段）通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。经特定的染料染色后在紫外检测仪上检测扩增产物的多态性，这些扩增的DNA片段长度的多态性反映了基因组相应区域的DNA序列多态性。

  A图：引物结合部位的碱基置换(Base substitutions at the primer binding sites)引起的多态性；

  B图：单碱基突变(single base mutation)引起的多态性。

             图.电泳图谱显示不同个体DNA序列多态性差异

（3）优点：

  ①丰富性大，能反映整个基因组的变化；

  ②极强的探测性，无需合成特定序列引物；高效性和灵敏性；       

  ④技术简单，操作方便；

  ⑤所需样品DNA量少（10-100ng），质量要求低；

  ⑥环境污染小。

（4）缺点：

  ①稳定性低，同一反应不同次难重复，不同实验室难重复；

  ②显性遗传，无法区分纯合型与杂合型；

  ③高度变异性，即使在亲缘关系非常近的物种间，结果也造成很大差异。

（5）技术路线图：

   提DNA→PCR→电泳→分析。

       3.AFLP分子标记：

（1）定义：以扩增片段长度多态性（amplified fragmentlength polymorphism, AFLP）为分子标记，该标记选择性扩增基因组DNA酶切片段，获得限制性酶切片段的长度多态性，进而对多态性进行分析。

（2）原理：AFLP 是 RFLP 与RAPD相结合的产物，其基本原理是先利用限制性内切酶水解基因组 DNA 产生不同大小的DNA 片段，再使双链人工接头与酶切片段相连接，作为扩增（PCR）反应的模板DNA，然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，最后在接头互补链的基础上添加 1-3个选择性核苷酸作引物对模板 DNA 基因再进行选择性扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的DNA扩增片段，根据扩增片段长度的不同检测出多态性。
                           AFLP技术模式图（上、下）

图.不同地理群体西施舌的AFLP电泳图谱

  该技术的独特之处在于所用的专用引物在知道 DNA 信息的前提下就可对酶切片段进行PCR 扩增。为使酶切浓度大小分布均匀，一般采用两个限制性内切酶，一个酶为多切点，另一个酶切点数较少，因而 AFLP 分析产生的主要是由两个酶共同酶切的片段。

（3）优点：

  ①AFLP 结合了 RFLP 和 RAPD两种技术的优点，具有分辨率高、稳定性好、效率高的优点；

  ②标记数量多（内切酶和碱基组合可以调整）；

  ③多态程度高（50-100带/次）；

  ④典型的孟德尔方式遗传。

  ⑤无物种特异性；

  ⑥模板用量少；

  ⑦便于基因定位和克隆。

 （4）缺点：

   ①成本高；

   ②内切酶质量要求高；

   ③DNA质量要求高。

  尽管 AFLP 技术诞生时间较短，但可称之为分子标记技术的又一次重大突破，被认为是一种十分理想、有效的分子标记。这些技术在品种鉴别，目的基因定位及遗传图谱构建中得到了广泛的应用。

（5）技术路线图：

   基因组DNA提取→ 限制性核酸酶双酶切基因组DNA→DNA片段两端连接上特定的接头→ 选择扩增→ 聚丙烯酰胺凝胶电泳→ 凝胶转移，干胶处理→自显影。

   4.SSR分子标记：

 （1）定义：以简单重复序列(Simple Sequence Repeats, SSRs)，又称微卫星DNA(microsatellite DNA)或短串联重复序列(Short Tandem Repeat ,STR）为分子标记，该标记根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，通过电泳获得核心序列的长度多态性，并对其多态性进行分析。

（2）原理：微卫星DNA重复单位序列在卫星DNA分类中属于最短，由几个（1-10个）核苷酸组成重复单位，只有2～6bp，重复单位串联成簇，长度50～100bp。如（CA）n、（TG）n、（AT）n、（CC）n、（GATA）n；n代表重复次数。每个SSR两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列（单一序列）。单拷贝序列在基因组中占50-80%，如人基因组中，大约有60-65%的序列属于这一类（下图）。

  拷贝序列中储存了巨大的遗传信息，编码各种不同功能的蛋白质。不同生物基因组中单拷贝序列和重复序列的比例差异很大。真核生物基因组中有许多未知功能的重复序列。SSR均可被转录，有些编码蛋白质，而另一些则位于非转译区的5′端和3′端不编码蛋白质。

  SSR标记根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，通过电泳获得核心序列的长度多态性。

（3）技术路线图：微卫星序列的获取（NCBI、测序等）→设计引物→DNA提取→PCR扩增→聚丙烯酰胺凝胶电泳(下图)→分析。

  （4）优点：

    ①SSR数量多，分布整个基因组，多态性高；

    ②检测到的为单一多等位基因位点；

    ③共显性，可鉴定出杂合子和纯合子；

    

   

       

   ④重复性好，稳定性高；

   ⑤DNA样品量少，且质量要求不高。

 （5）缺点：

   ①需要预知DNA序列；

   ②引物设计工作量大。

三、第三代分子标记（理解）

       5.SNP分子标记：    

（1）定义：以单个核苷酸的变异，包括单碱基的转换、颠换、插入、缺失等所引起的DNA序列多态性，即单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP) 为分子标记，该标记利用数据库中已有的SNP对特定种群的序列和发生频率开展研究，采用基因芯片技术、Taqman技术、分子信标技术和焦磷酸测序法，进行基因分型，从而获得单核苷酸多态性信息，并对其多态性进行分析。

       

       

图.两种标记的区别

       

（2）原理：是指利用数据库中已有的SNP进行特定种群的序列和发生频率的研究，主要包括基因芯片技术，Taqman技术，分子信标技术和焦磷酸测序法等，从而获得基因分型。

  ①基因芯片技术：是在固相支持介质上进行分子杂交和原位荧光检测的一种高通量SNP分析方法。优点是高通量，一次可对多个SNP进行规模性筛选，被捡起材料也很少，操作步骤简单。缺点是芯片设计成本高，由于DNA样品的复杂性，有些SNP不能被捡起。

  ②Taqman技术：在pcr反应系统中加入2种不同荧光标记的探针，它们分别与两个等位基因完全配对。探针运用了荧光共振能量转换技术，探针的5’端和3’端分别用特殊染料标记，称为供体-受体染料对或爆-猝灭燃料对。

  ③分子信标技术：与Taqman技术相似，分子信标技术也是在PCR反应体系中加入荧光标记的探针与靶序列杂交，通过仪器检测荧光值的变化，进行基因分型。优点是分子信标法在选择荧光染料时，不必像Taqman法那样考虑染料之间光谱的重叠性，一次可以使用4种或4种以上染料，同时对多个SNP进行分析；Taqman法和分子信标法优点都是简单操作，可以自动化。缺点是不能达到高通量分析，荧光探针费用高。

  ④焦磷酸测序法：由4种酶催化同一反应体系中的酶级联反应，包括DNA聚合酶、硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶，反应底物为adenosine5’phosphosulfate 和荧光素，是一种不依赖平板胶或毛细管电泳，不依赖DNA的荧光标记/激发/检测体系的序列分析技术，适用于已知SNP的序列验证及基因分型。

  理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。这种变异可能是转换，也可能是颠换。转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有转换型变异的SNP约占2/3，其它几种变异的发生几率相似。

  下述为SNP变异来源-碱基置换：

  ①转换transition：AT→GC及GC→AT

   一种嘧啶置换另一种嘧啶　T↔C

   一种嘌呤置换另一种嘌呤　A↔G 
没有被及时除去的突变可以通过下一轮复制永久插入基因组，形成SNP。

  ②颠换   transversion：AT→TA或CG,GC→CG或TA      嘌呤与嘧啶互换，C↔A，A↔T等 

  ③缺失/插入：不常见

  碱基置换的后果可能是： 

  ①同义突变（silent mutation），位于密码子第三碱基的置换，由于遗传密码的简并，经转录和翻译所对应的氨基酸不变。

  ②错义突变（missense mutation），碱基置换使密码子的意义改变，经转录和翻译所对应的氨基酸改变。

  ③无义突变（nonsense mutation），碱基置换使密码子成为终止密码，导致肽链延长提前结束。

  ④终止密码突变(terminator codon mutation)，碱基置换使终止密码转变成某种氨基酸密码，指导合成的肽链将延长到出现第二个终止密码才结束。

（3）技术路线图：

  提取基因组DNA→设计并合成SNP引物→PCR扩增→分型检测→直接测序→与已知序列进行比对→液相质谱→高分辨率溶解曲线。

（4）优点：

  ①密度高-SNP在人类基因组的平均密度估计为 1\1000bp , 可以在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标记。

  ②富有代表性-某些位于基因内部的SNP 有可能直接影响蛋白质结构或表达水平，因此，它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素。 

  ③遗传稳定-与微卫星等重复序列多态性标记相比，SNP具有更高的遗传稳定性。

  ④易实现分析的自动化-SNP标记在人群中只有两种等位型，所以它是一种二态的标记，即二等位基因（biallelic）。 由于SNP的二态性，非此即彼，检测时只需一个“ + \- ”或“全\无”的方式，检测分析方法易实现自动化。

（5）缺点：

  对测序的精度要求高。

       6.DNA条形码：

（1）定义：DNA条形码（DNA barcode）是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段，是一个物种的标记。该标记以传统的DNA测序技术为基础，通过对一组来自不同生物个体的短的同源DNA序列（约800bp）进行PCR扩增和测序，对测得的序列进行多重序列比对和聚类分析，从而将某个个体精确定位到一个已描述过的分类群中，实现DNA序列和生物物种之间的一一对应关系。

  DNA条形码技术是利用生物体DNA中一段保守片段对物种进行快速准确鉴定的新兴技术。2003年，全球多位生物学专家深入讨论了DNA条形码的科学性和社会功能，提出了国际DNA条形码计划。

  DNA条形码已经成为生态学研究的重要工具，不仅用于物种鉴定，同时也帮助生物学家进一步了解生态系统内发生的相互作用。在发现一种未知物种或者物种的一部分时，研究人员便描绘其组织的DNA条形码，而后与国际数据库内的其他条形码进行比对。如果与其中一个相匹配，研究人员便可确认这种物种的身份。  

     

（2）原理：在DNA分类学(DNA Taxonomy，即以DNA序列作为生物分类系统平台)的基础上，针对形态学分类固有的缺陷，如表型可塑性和遗传可变性、无法鉴定隐存分类单元和不同发育阶段的物种等，加拿大动物学家Paul Hebert等对动物界，包括脊椎动物和无脊椎动物共11门13320个物种的线粒体细胞色素C氧化酶亚基基因序列进行比较分析，除腔肠动物Cnidaria外，98%的物种遗传距离差异在种内0%～2%，种间平均可达到11.3%，据此提出可以用单一的小片段基因来代表物种，作为物种的条形编码，为全球生物编码，即DNA条形码(DNAbarcoding)。它是利用一段标准DNA 序列作为标记来实现快速、准确和自动化的物种鉴定，类似于超市利用条形码扫描区分成千上万种不同的商品。因此，Hebert等在2003年提出了DNA条形码的概念，首先倡导将条形码编码技术应用到生物物种鉴定中，因此他被称为DNA条形编码之父。        

  理想的DNA barcoding应当符合下列标准：

  ①具有足够的变异性以区分不同的物种，同时具有相对的保守性；

  ②必须是一段标准的DNA区来尽可能鉴别不同的分类群；

  ③目标DNA区应当包含足够的系统进化信息以定位物种在分类系统(科、属等)中的位置；

  ④应该是高度保守的引物设计区以便于通用引物的设计；

  ⑤目标DNA区应该足够的短以便于有部分降解的DNA的扩增。          

   NA barcoding作为生物“种水平species-level”鉴定的工具引人注目。Genbank数据库中CO I序列（细胞色素c氧化酶亚基 I）正在快速增加。Min等分析了CO I序列及其来源基因组核苷酸含量之间的关系，结果表明849个CO I基因的5端的DNA barcoding序列令人惊奇地准确地代表了其来源完整线粒体基因mtDNA的重要信息，也就是说对于未测序的基因组，从DNA barcoding能快速预知完整基因组的组成 。

（3）技术路线：

  提取基因组DNA→合成引物→PCR扩增→克隆→测序分析

（4）优点：

  ①准确性高，可以鉴别形态上高度相似或表型性状可塑性高的物种；

  ②通过建立DNA条形码数据库，汇聚全球的物种资料，加速新种和隐存种的发现；

  ③简单、快速、通量高的鉴定物种。

（5）缺点：

  DNA条形码提出之初，强调用统一的基因（线粒体CO I）序列进行鉴定物种，如果进化过慢，则难以鉴定。目前多基因分析法被普遍接受，必要时还要和传统的分类方法相结合。

（6）DNA条形码分子鉴定常用方法：

  ①ITS2：

  ITS（internal transcribed spacer of nuclear ribosomal DNA），细胞核的核糖体DNA内部转录间隔区，是码核糖体RNA前体基因的一段，位于核仁区，多用来进行进化分析。ITS位于18S rRNA基因和28S rRNA基因之间，中部被5.8S rRNA基因一分为二，即ITS1(the first internal transcribed spacer)区和ITS2(the second internal transcribed spacer)区。5.8S、18S和28S进化速率较慢，常用于探讨科级和科级以上等级的系统发育问题。而间隔区ITS(包括ITS1和ITS2)进化速率较快，一般用于研究属间、种间甚至居群间等较低分类等级的系统关系。

  ②psbA-trnH：

  psbA-trnH基因间区是位于叶绿体基因psbA基因和trnH基因之间的一段非编码区，该间区进化速率较快，常用于植物属间、种间的系统发育研究。

  ③CO I：

  CO I为线粒体基因组的蛋白质编码基因，全称为细胞色素c氧化酶亚基 I (cytochrome c oxidase subunit I)，由于该基因进化速率较快，常用于分析亲缘关系密切的种、亚种及地理种群之间的系统关系。

四、几种分子标记的综合比较（理解） 

      

复习题：

一、问答题：

1.试述AFLP分子标记的原理及其优缺点。 

2.试述SNP分子标记的原理及其优缺点。

3.试述DNA条形码分子鉴定常用的方法。

二、简答题：

1.试述RFLP分子标记的原理及其优缺点。

2.试述RAPD分子标记的原理及其优缺点。

3.试述SSR分子标记的原理及其优缺点。

4.试述SNP变异的主要来源。

5.试述DNA条形码的原理及其优缺点。

6.请对几种分子标记进行综合比较。

三、名词解释：

1.RFLP分子标记；

2.Southern印迹杂交；

3.RAPD分子标记；

4.AFLP分子标记

5.SSR分子标记；

6.SNP分子标记;

7.基因芯片技术；

8.DNA条形码。