一、名词解释
1. restrictionen endonuclease
答案：限制性核酸内切酶:又简称为限制性内切酶或限制酶,是一类核酸内切酶,能识别双链DNA分子内部的特异位点并裂解磷酸二酯键。
2. palindrome
答案：回文结构:又称反向重复序列,是指在2条核苷酸链中,从5′→3′方向的核苷酸序列是完全一致的。
3. transposition
答案：转座:大多数基因在基因组内的位置是固定的,但有些基因可以从一个位置移动到另一个位置。这些可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。由插入序列和转座子介导的基因移位或重排现象称为转座。
4. site specific recombination
答案：位点特异性重组:由位点特异性重组酶催化,在拥有一定程度序列同源性片段间DNA链的互换过程。
5. homologous recombination
答案：同源重组:是指发生在同源序列间的重组,通过链的断裂和再连接,在2个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。
6. vector
答案：载体:为携带目的外源DNA片段,实现外源DNA在受体细胞中的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
7. cloning vector
答案：克隆载体:用于外源DNA片段的克隆和在受体细胞中扩增的一类载体。
8. expression vector
答案：表达载体:用于外源基因表达的一类载体。
9. transformation
答案：转化:通过自动获取或人为地供给外源DNA,使受体细胞获得新的遗传表型。
10. transfection
答案：转染:将外源DNA直接导入真核细胞(酵母除外)的过程。
11. genome DNA
答案：基因组DNA:是指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。
难易程度：
答案解析：略
题型：名词解释
12. target gene
答案：目的基因:应用重组DNA技术有时是为分离、获得某一感兴趣的基因或DNA序列,或是为获得感兴趣的基因的表达产物——蛋白质,这些感兴趣的基因或DNA序列,就是目的基因,又称目的DNA。
13. DNA cloning
答案：DNA克隆:应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗传物质(DNA)与载体DNA接合成具有自我复制能力的DNA分字—复制子,继而通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增,提取获得大量同一DNA分子,也称基因克隆或重组DNA。
14. competent cell
答案：感受态细胞:选择适当的受体菌,经适当的理化方法处理后,使宿主细胞处于最适摄取和容忍重组体的状态(细胞膜通透性增加),即为感受态细胞。
15. transduction
答案：转导作用:当病毒从被感染的细胞(供体)释放出来、再次感染另一细胞(受体)时,发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。
二、填空题
1.细菌中,可以通过 、 、 和 4种方式,在不同DNA分子间发生基因转移。
答案：接合作用；转化作用；转导作用；细胞融合；
2.最基本的DNA重组方式是 。其发生在重组 。
答案：同源重组；同源序列间；
3.位点特异性重组是在 酶催化下发生的DNA片段的重排。
答案：位点特异性重组在2个DNA序列的特异；
4.转座重组由 和 介导,引起基因移位和重排。
答案：插入序列；转座子；
5.在基因工程中最主要的工具酶是 ,其功能为 和 。
答案：限制性核酸内切酶；识别特异序列；切割DNA；
6.质粒是 ,它具有 功能。
答案：存在于细菌染色体外的环状双链DNA；独立复制；
7.基因组DNA文库含有组织或细胞的 信息,cDNA文库含有组织或细胞的 信息。
答案：基因组；信使RNA；
8.可充当克隆载体的DNA分子有 、 和 。
答案：质粒DNA；噬菌体DNA；病毒DNA；
9.科学家感兴趣的外源基因又称 ，其来源有几种途径： 、基因组DNA文库、cDNA文库及 技术。
答案：目的基因；化学合成法；PCR；
10.重组体的筛选中的直接选择法,主要指 、 和插入失活筛选。
答案：抗药性标志筛选；标志补救筛选；
11.在蛋白质表达领域,表达载体的建立包括 、 、
和 等技术和策略。
答案：表达载体的构建；受体细胞的建立；表达产物的分离；纯化；
三、简答题
1.简述克隆载体应具备的基本特点。
答案：答：作为克隆载体,应具备如下基本特点:①至少有一个复制起点,使载体在宿主细胞中进行自主复制,并能使克隆的外源DNA得到同步扩增;②至少有个选择标志;③有适宜的RE单一切点,可供外源基因插入时选择。
2.获取目的DNA的方式有哪些?
答案：答：获得目的DNA的方法有:①化学合成法;②从基因组DNA文库和cDNA文库中获取目的DNA;③PCR法;④利用酵母单杂交系统或双杂交系统克隆基因。
3.简述基因位点特异性重组和同源重组的差别。
答案：答：位点特异性重组需要位点特异性重组酶,发生在至少拥有一定程度序列同源性片段间DNA链的互换,有特异性重组位点;同源重组不需特异性重组位点,而是依赖两分子之间序列的相同性或类似性,但也需要特异酶催化。
4.克隆载体上常见的抗药性标志基因有哪些?它们有何作用?
答案：答：克隆载体上常携带的抗药性标志基因有ampR、tetR、kanR等。转化后有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗生素的培养板上生存并形成菌落,这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。
5.真核表达载体中neo基因编码的产物是什么?有何作用?
答案：答：真核表达载体中的neo基因为筛选的遗传标志,neoR基因编码的产物是新霉素磷酸转移酶。该酶可使加入到细胞培养液中的新霉素类似物(G418)磷酸化而失活,稳定转染的细胞就会在含G418的培养液中存活并增殖,起到筛选转染细胞和非转染细胞的作用。
6.简述重组DNA技术的基本步骤。
答案：答：重组DNA技术的基本步骤分为5步。①分:目的DNA的分离获取②选:载体的选择与构建;③连:的DNA与载体连接;④转:重组DNA转入受体细胞:⑤筛:重组体的筛选与鉴定。
四、论述题
1.试述原核表达体系和真核表达体系各自的优缺点。
答案：答：原核表达体系如E.coli是当前采用最多的原核表达体系,其优点是培养方法简单、迅速、经济而又适合大规模生产工艺。其不足之处是由于缺乏转录后加工机制,只能表达克隆的cDNA,不宜表达真核基因组DNA(即含有内含子的DNA);表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进行糖基化修饰;表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体,欲使其具有活性尚需进行复杂的变性-复性处理;很难用E.coli表达体系表达大量的可溶性蛋白。
真核表达体系如酵母、昆虫及哺乳类动物细胞表达体系,尤其是哺乳类动物细胞表达体系,不仅可表达克隆的cDNA而且还可表达真核基因组DNA;哺乳类细胞表达的蛋白质通常被适当修饰,因此表达产物直接就有功能。但操作技术难、费时、不经济是哺乳类动物细胞表达体系的缺点。
2.何谓基因组DNA文库?如何构建?
答案：答：分离组织或细胞染色体DNA,利用限制性核酸内切酶将染色体DNA切成大小不同的DNA片段,其中即含有我们感兴趣的基因片段。将其与适当的克隆载体拼接成重组DNA分子,继而转入受体菌扩增,使每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。在不同细菌所包含的重组DNA分子内,可能存在不同的染色体DNA片段,这样生长的全部细菌所携带的各种染色体片段就代表了整个基因组。存在于转化细菌内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,称为基因组DNA文库。基因组DNA文库涵盖了基因组全部基因信息,也包括我们感兴趣的基因。建立基因文库后,需结合适当筛选方法,选出含有某一基因的菌落,再进行扩增,将重组DNA分离、回收,获得目的基因的无性繁殖系—克隆。
3.试述外源基因与载体的主要连接方式。
答案：答：外源基因与载体的主要连接方式有以下几种。
(1)黏性末端的连接方式。①同一限制性核酸内切酶切割位点连接:由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端,当这样的2个DNA片段连接时,黏性末端单链间进行碱基配对,然后在DNA连接酶催化作用下形成共价结合的重组DNA分子;②不同限制性核酸内切酶切割位点连接:由2种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段,产生2个不同的黏端,可使外源DNA定向插入载体。
(2)平端连接。DNA连接酶可催化相同和不同限制性核酸内切酶切割的平端之间的连接。
(3)同聚物加尾连接。同聚物加尾连接是利用同聚物序列,如多聚A与多聚T之间的退火作用完成连接。在末端转移酶作用下,在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出黏性末端,而后进行黏性末端连接,这是一种人工提高连接效率的方法,属于黏性末端连接的一种特殊形式。
(4)人工接头连接。对平端DNA片段或载体DNA,可在连接前将磷酸化的接头或适当分子连到平端,使产生新的限制性核酸内切酶位点,再用识别新位点的限制性核酸内切酶切除接头的远端,产生黏性末端,这也是黏性末端连接的种特殊形式。
