实验十一  动物细胞培养技术

一、实验目的

掌握动物细胞培养技术要点，细胞培养指的是细胞在受人工控制的环境中生长的过程。通过这一过程，细胞可以保持在体外生长，和器官以及组织培养相比这是相当简单的。在细胞培养技术中，细胞从动物或植物中去除，然后在有利的体外环境中生长。

1 根据细胞种类：原代细胞培养， 传代细胞培养

原代细胞：将动物各种组织从机体中取出，经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA) 或机械方法处理，分散成单细胞，在合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。培养的细胞为正常的动物细胞，一般培养10代后不再增殖，死亡。

传代细胞：传代培养是细胞培养常规保种方法之一，也是所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长，这一过程就叫传代。传代培养可获得大量供实验所需细胞。细胞传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细地无菌操作。培养的细胞为癌变或人为癌化的细胞，理论上可以无限增殖。癌化的方式有很多：进行癌基因突变，感染病毒，从癌症供体体内分离，物理或化学方法（如紫外，化学试剂）等。

2 根据培养方式：贴壁细胞培养，半悬浮细胞培养，悬浮细胞培养

3 动物细胞培养是从实验动物的器官中提取出细胞，细胞可以直接提取，也可以通过机械或酶的作用提取。这些细胞也可以通过细胞株获得。医学上用于培养细胞的例子有成纤维细胞、淋巴细胞、心脏和骨骼组织的细胞、肝、乳腺、皮肤和肾脏的细胞以及不同类型的肿瘤细胞等。

4 直接从宿主组织细胞获得细胞培养物，从亲代组织分离出来的细胞生长在合适的容器中，这种培养物称为原代细胞培养。这种培养物主要由异质细胞组成，大多数细胞只在有限的时间内分裂。然而，这些细胞与它们的母细胞非常相似。根据它们的起源，原代细胞既可以作为粘附的单层生长，也可以作为悬浮物生长。

5 原代细胞作为粘附的单层细胞生长称为贴壁细胞。这些细胞是具有依赖性的，并作为单层细胞增殖。这些细胞需要附着在固体或半固体基质上进行增殖。这些附着于培养容器中的细胞外基质，通常来源于固定在结缔组织网络中的器官组织。成纤维细胞和上皮细胞就是这样的类型。当原代培养是次培养时，被称为次级培养或细胞系或亚克隆。该过程涉及去除生长介质和分离的细胞（通常是酶）。

6 原代细胞向不同区域的亚分化导致细胞系的产生。在传代过程中，具有最高生长能力的细胞占优势，会导致种群的基因型和表型均一性。然而，由于它们是连续传代培养的，所以它们与原细胞不同。

二、步骤

取动物组织块——剪碎组织——用胰蛋白酶处理分散成单个细胞——制成细胞悬液——转入培养液中（原代培养）——放入二氧化碳培养箱培养——贴满瓶壁的细胞用酶分散为单个细胞制成细胞悬液——转入培养液（传代培养）——二氧化碳培养箱.

（1）复苏
1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。
2.把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。
3.把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。
4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。
5.3天换一次培养基。
   （2）传代
1.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。
2.把原有培养基吸掉。
3.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化1-2分钟。
4.细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化。
5.用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。
6.把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。
7.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。
8.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。继续培养。
    （3）冻存
把细胞消化下来并离心（同上）。用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。4℃ 30min，-20℃ 30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。
冻存液的配制： 70%的完全培养基 20%DMSO. DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。
要注意的就是无菌操作。