实验七  线粒体的活体染色和观察

一、 实验目的：

1、掌握线粒体活体染色的原理和方法；

2、了解光学显微镜下线粒体的基本形态和在细胞中的分布、掌握研究方法。

二、实验原理：

• 线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。

• 健纳绿B（Janus Green B）对线粒体具有专一性染色、毒性最小的碱性染料，由于线粒体中细胞色素酶系的作用，使它始终保持氧化状态，并呈现蓝绿色，在线粒体周围的细胞质中的染料被还原为无色的色基。

三、实验用材：

      常规解剖器、大白鼠肝细胞

四、实验步骤

     1、鼠肝边沿较薄组织小块，放入盛有Ringer氏液的培养皿内，洗去血液。

     2、将1/5000Janus Green B 染液倒入另一培养皿中，将肝组织移入其内，但不可将组织块完全淹没，要让组织上面部分半裸露在染液外面，这样，细胞内的线粒体的酶系可充分得到氧化，线粒体才易染色，一般染30-40分钟（组织块边缘染成蓝绿色即可）。

3、染色后，用两根解剖针，同时用左右两手， 用一手的针压住组织块，然后用另一手的针稍稍用力拉肝组织块边缘，就会有一些细胞或细胞群和组织块分离。

4、用吸管将分离的细胞吸起，放在载玻片中央的Ringer氏液中。垫两根头发，盖上盖玻片，液体不要太多。

5、油镜观察：观察时，不断地上下微调节螺旋，使盖玻片上下稍稍移动，这样所观察到的材料总得到充足的氧气，线粒体的染色才显示得非常清楚。

6、结果：油镜下，可见肝细胞质中线粒体被染成蓝绿色，呈颗粒状或线条状，在细胞核周围分布得特别多。

 1、Ringer氏溶液的配方：

NaCl                    8.5/6.5克

 CaCl2                   0.12克

重碳酸钠                 0.2克

 氯化钾                   0.14克

磷酸氢二钠               0.01克

葡萄糖                   2.0克

水                      1000ml

2、1% 1/5000浓度的健那绿B染液

称取0.5克Janus Green B溶于50mlRinger氏溶液中，微热（30-40℃）使之很快溶解。用滤纸过滤后即为1%原液。取1%原液1ml加入49mlRinger氏液中，即成1/5000工作液。装入滴瓶中备用。

五、作业

   1、绘制光镜下肝细胞活体染色所见的线粒体的形态结构。