实验五、细胞核、叶绿体、线粒体的分级分离及观察

 

一、实验目的

v 1，了解细胞器分离的一般原理与方法

v 2，掌握分级分离的原理和注意事项

v 3，观察叶绿体的自发荧光和次生荧光

v 4，熟悉线粒体的分离方法以及詹纳斯绿B

   超活染色的方法

二、实验原理

v 先用研磨、超声震荡、低渗等方法将组织或细胞破碎（或匀浆化），释放出细胞中的各种亚组分，再利用不同的离心条件将它们分离出来，以供进一步分析研究之用。

三、实验材料、试剂及仪器

1、新鲜菠菜叶;0.35M NaCl、0.01%吖啶橙、1% 詹纳斯绿B。

2、实验器材：光学显微镜、荧光显微镜、载玻片、研钵、胶头滴管、纱布等。

四、实验步骤

Ⅰ、细胞核与叶绿体的分离与观察

    1）选取新鲜菠菜叶，洗净后去除叶梗和粗脉，称30g进行研磨。

    2）在研钵中加入150 ml 0.35M的NaCl溶液，研磨成匀浆。

    3）将匀浆用6层纱布过滤于烧杯中。

    4）每小组取滤液于4 ml在1000 r/min的条  

    件下离心2 min。

5）取上清夜在3000 r/min的条件下离心5 min，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核），上清液转入干净的离心管中用于后续线粒体的分离。

6）叶绿体的观察：

v 将沉淀用少量的0.35 M NaCl溶液悬浮。（浓度不要太高，易观察）

v 取叶绿体悬浮液一滴于载玻片上，加盖玻片即可在普通显微镜下观察叶绿体形态。

v 取叶绿体一滴于载玻片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙，加盖玻片即可在荧光显微镜下观察。

Ⅱ、线粒体的分级分离及超活染色观察

1）取上一实验步骤5中获得的上清夜装入干净的离心管中，在高速冷冻条件下10000 r/min 离心10 min, 沉淀即为线粒体。

2）留适量溶液将沉淀悬浮，即用0.35 M NaCl溶液。

3）取一滴悬浮液于载玻上，用一滴1%詹纳斯绿B染液，染色时间为5-10 min, 线粒体为蓝绿色圆形颗粒。可在普通显微镜下观察。

五、作业

1、绘制在光学显微镜下所观察到细胞核、叶绿体及线粒体的形态结构图。