‍实验一  特殊显微镜的使用

 

一、实验目的：

1、掌握相差显微镜和荧光显微镜的原理、用途和使用方法；

2、掌握荧光显微镜的基本结构和使用注意事项；

3、了解暗视野显微镜的原理、用途和使用方法；

二、教学安排:

实验时间3学时。本实验强调规范使用和调试显微镜是细胞生物学实验非常重要的内容，是获得良好实验结果的基础。

三、主要内容:

   v 暗视野显微镜

   v 相差显微镜

   v 荧光显微镜

  内容一：暗视野显微镜

  v 根据丁达尔效应原理设计的一种在黑色背景条件下观察被检物体的显微镜

  v 观察到明场看不到的极其微小的物体

  v 最高分辨率可达0.004微米

1.1 原理

      丁达尔现象：在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了，这就是微粒发光。

     暗视野显微镜就是利用微粒发光原理设计的。

1.2 结构特点

     使用中央遮光板或暗视野聚光器（常用的是抛物面聚光器），使光源的中央光束被阻挡。不能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。

v 优点：分辨率比普通显微镜高50倍。

v 缺点：不能辨别细微结构。

v 应用：在某些细菌、细菌等活体检查中常常使用暗视野显微镜。

v 常用的暗视野照明法：

             中心遮光法

             暗视野聚光法

1.3成像特点及优缺点

     在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像，并非物体本身，所以只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。但被检物体为非均质时，并大于1／2波长，则各级衍射光线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。

     一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨0.004um以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜(最大的分辨力为0.2um)所不具有的特性，可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。

1.4 应用：微小粒子、细菌形态、细菌记数，透明标本观察等。

1.5 暗场显微镜的要求

v 要求载玻片和盖玻片必须无疵痕和灰尘

v 物镜前透镜必须清洁无尘

v 载玻片和盖玻片厚度必须绝对符合要求

1.6暗场观察方式调节

(1)换上暗场聚光镜（干燥系或油浸系）并在聚光镜透镜上表面滴上镜头油。向上缓慢调升聚光镜，使镜头油与载玻片底面相接触后。

(2)将视场光阑适当缩小，用10X物镜找到被检物体，同时在视场中看到视场光圈的轮廓象。上下缓慢调整聚光镜，使视场光圈像清晰可见。

(3)视场光圈如不在视野中央，可利用聚光镜外侧两个调节螺丝进行调整，再将其开大到相应位置。

 

内容二：相差显微镜

   2.1 原理

v 光的三要素：

    波长、振幅、相位

v 20世纪30年代初，德国物理学家泽尼克（Zernike）根据“相衬法”原理，于1932年制造出了世界上第一台相差显微镜，并因此获得1953年的诺贝尔物理学奖。

v 当照明光线通过活细胞时，虽然波长及振幅没有明显的变化，但由于细胞的各部分及细胞与周围介质之间折射率有所差别，光波透过后可产生相位的变化。

v 光线通过各种界面时，一部分仍为相位和振幅相同的直射光，另一部分由于光的衍射现象而向周围发散成衍射光。衍射光与

      直射光的波长一致，但相位不同。

v 一般衍射光的相位比直射光推迟约1/4λ，同时到达一点时，两者相互干涉，形成合成光，其强度取决于两光波的振幅和相位差。

v 在相差显微镜中，通过相板和环状光阑改变衍射光或直射光的相位，将直射光和衍射光的相位差变成振幅差。

v 如果推迟直射光的相位1/4λ，则直射光和衍射光的相位相同，发生相长干涉，合成光有2倍的振幅，样品最为明亮，称复反差。

v 如果推迟衍射光的相位1/4λ，则直射光比衍射光超前1/2λ，这时发生相消干涉，即波峰与波谷相遇，合成光比直射光暗，成正反差。

v 一般生物样品中各种结构推迟光程的能力不同，但都在上述两个极端之间，这样就会出现明暗程度的不同。

2.2 步骤

v 步骤：

v 1、相差显微镜的调试

v （1）光路调中：光路中心和照明光束的中心合一、聚光器调中的步骤为：

            1，把聚光镜调到最高位置；

            2，开启光源；

            3，转动转盘，使“O”进入标示孔；

            4，低倍镜聚焦样品；

            5，缩小视野光阑，在显微镜的视野里可见视场光阑的模糊图像；

            6，微降调聚光器使视场光阑的像清晰。    

       7，双手调节聚光器的两个调中螺杆，使视场中心移至视野中央。

            8，开放视场光阑，使其周边与视野周边相接，形成视野的内接多边形，如不能内接，则重复步骤7和8

       9，使聚光器升至顶点，光路调中即告完成。

（2）合轴调节

    在设计上，相差显微镜的共轭面的直径和宽度与环状光阑与相板共轭面的透光环是一致的，使用时，每一相差显微镜必与环状光阑相匹配，还要调节两环，使其合轴。

    调节方法：

1，从目镜筒中拔出目镜；

2，插入合轴调整望远镜，转动望远镜上面的螺旋，使其升降（不要从目镜筒中拔出望远镜），至两环清晰为止。

3，双手轻按转环状光阑调中螺杆并转动，使环状光阑移到环状光阑与相板共轭面完全重合为止。

4，如果环状光阑的大小与相板的大小不完全一致，升降聚光器，使之一致。

5，拔出望远镜，换入目镜后即可开始做镜检观察，环状光阑也应做相应转换。

内容三：荧光显微镜

3.1 原理

v 荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。

v 荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。荧光显微镜与普通光学显微镜可以共用一些部件（如机架等）

v 荧光显微镜是利用一定波长的光(通常是紫外光或蓝紫光)激发显微镜下标本内的荧光物质，使之发出荧光，呈现荧光影像。荧光显微镜包括光源、滤片系统和显微镜三个部分。

3.2  拓展：

1）  荧光的种类：

  自发荧光（固有荧光）

  二次荧光

2） 荧光的性质：

    吸收光，必需有激发光源

    荧光波长＞激发波长（损失热能）

    荧光强度极小于激发光的强度

    有不同程度的衰减

    荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率

3） 荧光显微镜的种类：

透射式：

汞灯光源；激发滤色镜；吸收滤色镜；暗场聚光镜

落射式：

汞灯光源；激发滤色镜；分色镜；吸收滤色镜

4）荧光光源：

     一般采用超高压汞灯(50一200W)，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。

每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免干扰荧光和损伤眼睛。二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用

3.3  使用方法：

1．打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点。

2．透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的阻断滤片。

落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的插块。

3．放置标本片，调焦后即可观察。 使用中应注意：末装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；

4．高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经5分钟后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。

3.4 用途

 1 观察标本中的自发荧光物质或以荧光素染色或标记的细胞和结构

 2 标本中的荧光物质在紫外线激发下产生各种颜色的荧光，借以研究该荧光物质在细胞和组织内的分布。组织中的自发性荧光物质如神经细胞和心肌细胞等内的脂褐素呈棕黄色荧光，肝贮脂细胞和视网膜色素上皮细胞内的维生素A呈绿色荧光，某些神经内分泌细胞和神经纤维内的单胺类物质（儿茶酚胺、5－羟色胺、组胺等）在甲醛作用下呈不同颜色的荧光，组织内含有的奎宁、四环素等药物也呈现一定的荧光。

 3 细胞内的某些成分可与荧光素结合而显荧光，如溴化乙锭与吖啶橙可与DNA综合，进行细胞内DNA含量测定。

 4 荧光显微镜更广泛用于免疫细胞化学研究，即以异硫氰酸或罗丹明等荧光素标记抗体（一抗或二抗），用该标记抗体直接或间接地与细胞内的相应抗原结合，以检测该抗原的存在与分布

四、试剂与器材：

鱼、草履虫、甲醇、5‰ 丫啶橙、滤纸、吸管、载玻片、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差光学显微镜

五、绘制实验结果图