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1 内容
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2 测验14.2
一、教学目标
1.掌握DNA的复制过程以及参与DNA复制的一些酶和蛋白质；
2.真核生物与原核生物DNA复制的主要差异；
3.逆转录的过程及其生物学意义。
二、教学重点
1. DNA合成的两条途径；
2. DNA的损伤和修复。
三、教学难点
比较分析DNA复制与逆转录的异同
一、与DNA复制有关的酶及蛋白质因子
目前已发现30多种酶及蛋白质因子参与DNA复制
（一）DNA的聚合反应和聚合酶
DNA生物合成5，→3，，化学合成3，→5，
1、DNA聚合反应必备的条件
⑴ DNA聚合酶
⑵ DNA模板(反转录时用RNA模板)
⑶引物 (DNA、RNA或蛋白质)
⑷ 4种dNTP
⑸ Mg2+
2、聚合反应过程及特点
在链的延长过程中，链的游离3，-羟基，对进入的脱氧核糖核苷三磷酸α磷原子发生亲核攻击，生成3，.5，-磷酸二酯键，并脱下焦磷酸。
3、DNA聚合酶的反应特点：
⑴ 以4种dNTP为底物
⑵ 反应需要接受模板的指导，不能催化游离的dNTP的聚合。
⑶ 反应需有引物3，-羟基存在
⑷ 链生长方向5， → 3，
⑸ 产物DNA的性质与模板相同
4、E.coli DNA聚合酶
（1）E.coli. DNA pol.I（Kornberg酶，400 copy/cell）
单体酶，分子量109Kd，含一个Zn2+，每个细胞中含400个DNA pol.Ⅰ
催化活性：
5， → 3， 聚合活性
3， → 5， 外切活性
5， → 3， 外切活性
用蛋白水解酶将DNA pol.Ⅰ部分水解可得：
大片段（Klenow），75Kd，活性：5， → 3，聚合活性、3， → 5，外切活性。
小片段，36Kd，活性：5， → 3，外切活性（只作用于双链DNA的碱基配对部分，切除修复）。
Klenow片段的用途：
a 补齐DNA 3，隐缩未端
b. 标记DNA片段未端
c．cDNA合成第二链
d．d DNA测序
（2）E.coli. DNA Pol.Ⅱ（100 copy/cell）
单体酶，分子量120Kd
催化活性：5，→ 3，聚合(活性很低)
3，→ 5，外切
可能在DNA的修复中起某中作用。
（3）E.coli.DNA pol.Ⅲ（复制酶，10-20 copy/cell）
寡聚酶，全酶由10种共22个亚基组成，α、ε和θ三种亚基组成核心酶。
DNA pol.Ⅲ是合成新链DNA主要的酶，又称复制酶(Replicase)
Pol.Ⅲ的5，→3，外切酶活性只作用于单链DNA。
★DNA聚合酶有6个结合位点
⑴ 模板DNA结合位点
⑵ 引物结合位点
⑶ 引物3，-OH位点、反应位点
⑷ 底物dNTP结合位点
⑸ 5， → 3， 外切位点(pol.Ⅱ没有)
⑹ 3， → 5， 外切位点(校正)
5、真核生物DNA聚合酶
真核DNA聚合酶一般不具备外切活力，可能由另外的酶在DNA复制中起校正功能。
⑴ DNA聚合酶α，多亚基，功能与E.coli. pol.Ⅲ类似，是真核DNA复制酶。
⑵ DNA聚合酶β，主要在DNA损伤的修复中起作用。
⑶ DNA聚合酶γ，从线粒体得到，可能与线粒体DNA的复制有关。
⑷ DNA聚合酶δ，特点：有3， → 5，外切活力。
（二）引物酶或RNA聚合酶（引发酶）
细胞内，DNA的复制需要引物（DNA或RNA），引物酶或RNA聚合酶可合成6-10个碱基的RNA引物。
★DNA复制为什么要用RNA引物？（为什么DNA聚合酶要用引物，RNA聚合酶不需要引物？）
⑴从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配
⑵新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链，DNA聚合酶的5，→3，校对功能难发挥作用。
（三）解螺旋酶
大肠杆菌的解螺旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ与rep蛋白共同作用，将DNA两条链解开。
解螺旋酶I、II、III沿着模板链的5’→3’方向随着复制叉的前进而移动，而rep蛋白则在另一条模板链上沿3’→5’方向移动。
（四）DNA旋转酶
属DNA拓扑异构酶Ⅱ，可引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。
拓扑异构酶分两类：I和II，广泛存在于原核生物和真核生物。
拓扑异构酶I使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无须供给能量，主要集中在活性转录区，与转录有关。
拓扑异构酶Ⅱ使DNA的两条链同时断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由ATP供给能量。分布在染色质骨架蛋白和核基质部，与复制有关。
（五）单链DNA结合蛋白（SSB）
复制叉上的解螺旋酶，沿双链DNA前进，产生单链区，大量的单链DNA结合蛋白与单链区结合，阻止复性和保护单链DNA不被核酸酶降解。
（六）DNA连接酶（ligase）
连接双链DNA上的切口。
大肠杆菌连接酶只能在模板上连接DNA缺口。T4DNA ligase即可连接粘性末端的DNA，又可连接平齐末端的双链DNA。
E.coli.和其它细菌的DNA ligase以NAD为能源，动物细胞和噬菌体DNA ligase以ATP为能源。
