三、细菌的人工培养
不同种类的原核微生物对营养、环境条件等的需求不同,进行人工培养时,要根据其种类选择适当的培养方法与培养基。
(一)细菌培养技术
普通细菌一般以培养基进行人工培养,根据不同培养对象和不同培养目的,选用不同的接种和培养方法。常用的有分离培养和纯培养两种方法。已接种标本或细菌的培养基置于合适的气体环境,需氧菌和兼性厌氧菌置于空气中即可,专性厌氧菌须在无游离氧的环境中培养。多数细菌在代谢过程中需要CO2,但分解糖类时产生的CO2已足够其所需,且空气中还有微量CO2,不必额外补充。只有少数菌如布鲁菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等,初次分离培养时必须在5%~10% CO2环境中才能生长。
(二)常用培养基
培养基(culture medium)是根据细菌生长繁殖的需要,按一定比例配制而成的营养物制品。培养基本身必须无菌,pH一般为7.2~7.6,对少数细菌按其生长要求调整pH为偏酸或偏碱。培养基按其用途和组成可分为以下几类:
1.基础培养基(basal medium):含有一般细菌生长繁殖所需的最基本营养成分。如肉浸液、肉膏汤,其组成为肉膏、蛋白胨、氯化钠和水。
2.营养培养基(nutrient medium):在基础培养基中添加某些特殊的营养物质(如葡萄糖、血液、血清、动物腹腔液、酵母浸膏、生长因子等),以满足营养要求较高的细菌生长。最常用的营养培养基是血琼脂平板。
3.选择培养基(selective medium):利用细菌对某些化学物质的敏感性不同,在培养基中加入该物质,以抑制混杂细菌,筛选出目标菌。如用于肠道病原菌(沙门菌属、志贺菌属)分离的S-S培养基。
4.鉴别培养基(differential medium):给培养基中加入某些底物和指示剂,使细菌培养后出现某种肉眼可见的特征性变化,用以鉴别细菌。如无糖基础培养基(蛋白胨水)、醋酸铅培养基等。
5.厌氧培养基(anaerobic medium):用于厌氧菌的分离、培养和鉴别。厌氧培养法主要有:①将普通培养基置于无氧环境中(专性厌氧缸或真空干燥缸内)培养;②在培养基中加入还原剂,以降低培养基的氧化还原电势,并加入美兰作为氧化还原指示剂。也可在液体培养基表面用凡士林或石蜡封闭以隔绝空气,造成无氧环境,常用的有庖肉培养基等。
根据培养基的物理性状,可分为液体培养基、固体培养基、半固体培养基。三种培养基的营养成分完全相同,只需在液体培养基中加入不同浓度的凝固剂(琼脂)即可制成固体培养基(2%~3%琼脂)和半固体培养基(0.3%~0.5%琼脂)。液体培养基常用于大量繁殖细菌。固体培养基用于分离纯化细菌。半固体培养基常用于检查细菌的动力或保存菌种。
(三)细菌生长现象的观察
1.液体培养基:普通兼性厌氧菌生长后使液体呈均匀混浊状态;链球菌等少数细菌可沉淀生长;专性需氧菌则多生长在液体表面,形成菌膜。
2.固体培养基:将细菌划线接种于固体培养基表面,在合适温度下培养一段时间后,在培养基表面出现由单个细菌繁殖而形成的、肉眼可见的细菌集团,称为菌落(colony),这一过程即为分离培养。挑取一个菌落转种到另一个新鲜培养基中则可获得该菌的纯种,称为纯培养(pure culture)。不同细菌菌落的大小、颜色、透明度、表面与边缘情况、光滑或粗糙、湿润或干燥、有无溶血性等表现各不相同,有助于识别和鉴定细菌。此外,卫生学检测中通过培养细菌菌落来计数检品的含菌量。
3.半固体培养基:用穿刺针将细菌接种于半固体培养基中培养后,有鞭毛的细菌沿穿刺线向周围扩散生长,可见整个培养基呈云雾状,穿刺线模糊不清。无鞭毛的细菌只能沿穿刺线生长,不向周围扩散,培养基仍透明,穿刺线清晰可见。
(四)细菌培养在医药学中的意义
1.细菌研究和鉴定:在研究细菌形态、代谢活动、生化反应、抗原性、致病性、耐药性等生物性状以及鉴定细菌时,需要对细菌进行分离和培养。
2.疾病诊断与防治:临床上从患者体内分离出细菌并予以培养,经过鉴定,才能明确诊断。细菌药物敏感试验也离不开细菌培养。
3.生物制品制备:以分离培养的纯细菌可制备抗生素、维生素、氨基酸、诊断菌液、菌苗、类毒素、菌体制剂、酶制剂等。也可以细菌为抗原,制备免疫血清或抗毒素。
4.基因工程应用:由于细菌结构简单、繁殖快、易培养,故在基因工程中常被用作工程菌。将带有外源性基因的重组DNA转化给受体菌,使其在菌体内获得表达后对细菌进行大量培养,进而获取生产基因工程产品,如胰岛素、干扰素、乙型肝炎疫苗等。