硫酸庆大霉素及其制剂的分析

  硫酸庆大霉素属氨基糖苷类抗生素，为氨基环己多元醇和氨基糖形成的苷。其结构如下：

                  绛红糖胺    2-脱氧链霉胺   加洛糖胺

庆大霉素

庆大霉素分子中有五个碱性中心，为碱性化合物，药物为庆大霉素的硫酸盐。庆大霉素是C组分的复合物，主要成分为C1、C2、C1a及C2a等，其结构如下：

一、硫酸庆大霉素的分析

(一)鉴别

  1．薄层色谱法  《中国药典》采用薄层色谱法鉴别本品。取本品与庆大霉素标准品，分别加水制成每1ml中含2.5mg的溶液，取上述两种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，用取三氯甲烷-甲醇-氨溶液（1:1:1)混合振摇，放置1 小时，分取下层混合液为展开剂，展开，取出于20~25°C晾干，置碘蒸气中显色，供试品溶液所显主斑点数、位置和颜色应与标准品溶液主斑点数、位置和颜色相同。

2．HPLC法 在庆大霉素C 组分测定项下记录的色谱图中，供试品溶液各主峰保留时间应与标准品溶液各主峰保留时间一致。

  3．红外分光光度法 《中国药典》采用红外分光光度法鉴别本品，用溴化钾压片后测定，要求供试品的红外吸收光谱与对照的图谱一致。

    4．硫酸盐的鉴别反应 本品的水溶液显硫酸盐的鉴别反应。

  (二)检查

  1．水分的检查  取本品，照水分测定法(费休法)测定，含水分不得过15.0％。

  2．硫酸盐  本品为庆大霉素的硫酸盐，此项目是检查SO的量是否符合要求。本品中SO含量的理论值约为34％，《中国药典》使用配位滴定法测定，

规定SO含量应为32.0％～35.0％。检查的方法为：

  取本品约0.125g，精密称定，加水100ml使溶解，用浓氨溶液调节pH值至11，精密加氯化钡滴定液(0.1mol/L)10ml及酞紫指示液5滴，用乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05mol/L)滴定，注意保持滴定过程中的pH值为11，滴定至紫色开始消退，加乙醇50ml，继续滴定至紫蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml氯化钡滴定液(0.1mol/L)相当于9.606mg硫酸盐(SO)。

  先加入一定量过量的氯化钡滴定液，Ba2+与SO形成BaSO4沉淀，剩余的Ba2+再用EDTA滴定液滴定，用酞紫作指示剂。1mol的BaCl2相当于1mol的SO，所以1ml氯化钡滴定液(0.1mol/L)相当于9.606mg的SO。

  3．细菌内毒素  取本品，照《中国药典》附录“细菌内毒素检查法”检查，1mg庆大霉素单位中含内毒素的量应小于0.50EU。

  4．C组分  庆大霉素是C组分的复合物，不同的C组分活性无明显差异，但其毒副作用不同，所以需控制C组分的相对含量。《中国药典》的检查方法如下：

  色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(pH值范围0.8～8.0)；以0.2mol/L三氟醋酸-甲醇（96:4）为流动相，流速为每分钟0.6~0.8ml；用蒸发光散射检测器检测(参考条件：漂移管温度105~110℃，载气流量为每分钟2.5L；低温型分流模式：漂移管温度为45~55℃，载气压力为350kPa)，取庆大霉素标准品、小诺霉素标准品和西索米星对照品各适量，分别加流动相溶解并稀释制成每1mL中约含庆大霉素总C组分2.5mg、小诺霉素0.1mg和西索米星25μl的溶液。取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，庆大霉素标准品溶液色谱图应与标准图谱一致，西索米星峰和庆大霉素C1a峰之间，庆大霉素C2峰、小诺霉素峰和庆大霉素C2a峰之间的分离度均应符合规定；西索米星对照品溶液色谱图中主成分峰峰高的信噪比应大于20；精密量取小诺霉素标准品溶液20μl，连续进样5 次，峰面积的相对标准偏差应符合要求。

  测定方法：精密称取庆大霉素标准品适量，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含庆大霉素总C 组分1.0mg、2.5mg、5.0mg的溶液，作为标准品溶液（1)、（2 )、（3) 。精密量取上述三种溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，计算标准品溶液各组分浓度对数值与相应峰面积对数值的线性回归方程，相关系数(r)应不小于0.99；另精密称取本品适量，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含庆大霉素2.5mg的溶液，同法测定，用庆大霉素各组分的线性回归方程分别计算供试品中对应组分的量（CtCx)，并按下面公式计算出各组分的含量（%，mg/mg），C1应为14%~22%，C1a应为10%~23%，C2a + C2应为17%~36% ，四个组分总含量不得低于50.0%。

式中，CX为庆大霉素各组分的含量（%，mg /mg）；CtCx 为由回归方程计算出的各组分的含量(mg/ml)；mt为供试品重量(mg)；Vt 为体积(ml)。

根据所得组分的含量，按下面公式计算出庆大霉素各分的相对比例。C1应为25%~50%，C1a应为15%~40%，C2a + C2应为20%~50% 

式中C’x为庆大霉素各组分的相对比例。

  由于庆大霉素无紫外吸收，《中国药典》2005年版采用蒸发光散射检测器检测。蒸发光散射检测器是一种新型的通用型的检测器，检测的原理是将色谱柱流出的流动相和组分引入通有气体(常用高纯氮)的蒸发室中，加热，使流动相蒸发除去，样品组分在蒸发室内形成气溶胶，而后进入检测室，用强光或激光照射气溶胶产生光散射，通过测定散射光强度而获得组分的浓度信号。蒸发光散射检测器主要用于糖类、脂肪酸等无紫外吸收组分的检测。使用蒸发光散射检测器，色谱峰面积和测定组分的浓度之间不成线性关系，须分别取对数后，方有线性关系。

  本法使用小诺霉素为对照品，采用标准曲线法测定各组分的含量。

5．酸度 取本品，加水制成每1ml中含40mg的溶液，依法测定，pH值应为4 .0~6 .0。6．溶液澄清度与颜色 取本品5份，各0.4 g，分别加水5ml使溶解，溶液应澄清无色；如显浑浊，与1号浊度标准液比较，均不得更浓；如显色，与黄色或黄绿色2 号标准比色液比较，均不得更深。

7．有关物质 精密称取西索米星对照品和小诺霉素标准品各适量，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含西索米星和小诺霉素各25μg、50μg和100μg的溶液，作为标准品溶液（1 )、（2 )、（3 )。照庆大霉素C 组分项下的色谱条件试验，精密量取标准品溶液（1 )、（2 )、（3 )各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，计算标准品溶液浓度对数值与相应峰面积对数值的线性回归方程，相关系数（r) 应不小于0.99 ；另精密称取本品适量，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含庆大霉素2.5mg的溶液，同法测定，记录色谱图至庆大霉素C1峰保留时间的1.2 倍，供试品溶液色谱图中如有西索米星峰、小诺霉素峰，用相应的线性回归方程计算西索米星、小诺霉素的含量。含西索米星不得过2.0% ，小诺霉素不得过3.0% 。除硫酸峰和亚硫酸峰外(必要时用硫酸盐和亚硫酸盐定位），其他杂质峰按西索米星线性回归方程计算，单个杂质不得过2.0% ，总杂质不得过4.5% 。供试品溶液色谱图中小于0.1% 的杂质峰忽略不计。

8．炽灼残渣 不得过0.5%

  (三)含量测定

  精密称取本品适量，加灭菌水定量制成每1ml中约含1000单位的溶液，照抗生素微生物检定法测定。可信限率不得大于7%。1000庆大霉素单位相当于1mg庆大霉素。

二、硫酸庆大霉素制剂的分析

《中国药典》收载的硫酸庆大霉素制剂有片剂、注射液、缓释片、颗粒剂和滴眼液等。

1．鉴别  以上五种制剂的鉴别试验均与硫酸庆大霉素原料药相同。

2．检查  硫酸庆大霉素注射液要求检查庆大霉素C组分，检查的方法和要求与原料药相同，此外还需检查pH值、颜色、无菌和细菌内毒素等。

  硫酸庆大霉素缓释片要求进行“释放度”的检查。照“释放度测定法”第一法测定，以0.1mol/L的盐酸溶液为释放介质，于2小时、4小时、6小时取释放溶液，与邻苯二醛发生衍生化反应后，用一阶导数光谱法测定含量。要求2小时、4小时、6小时的释放量分别为45％～70％、60%～85％和80％以上。

3．含量测定  硫酸庆大霉素制剂的含量测定均采用抗生素微生物检定法，《中国药典》规定，以上五种制剂的含量均应为标示量的90.0％～110.0％。