青霉素钠和青霉素钾

青霉素钠和青霉素钾属β-内酰胺类抗生素。以青霉素钠为例，其结构如下：

   青霉素类药物的结构由母核和侧链两部分组成。母核为6-氨基青霉烷酸，由β-内酰胺环和氢化噻唑环并合而成，C3上有一个羧基。不同的侧链构成不同的药物。青霉素钠(钾)的侧链为苄基，母核上的羧基形成钠盐为青霉素钠，形成钾盐即为青霉素钾。

 青霉素钠(钾)的侧链上有苯环，所以有紫外吸收；结构中的β-内酰胺环不稳定，与酸、碱、青霉素酶及某些金属离子作用时，易水解开环，并发生分子重排，使药物的活性降低。本类药物在碱性条件或在青霉素酶的作用下，β-内酰胺开环形成青霉噻唑酸，在pH4的酸性条件下可开环、重排成青霉烯酸，其降解的最终产物为青霉醛和青霉胺。

一、鉴别

 1．高效液相色谱法  《中国药典》采用高效液相色谱法测定青霉素钠和青霉素钾的含量，同时进行鉴别。要求在含量测定项下记录的色谱图中，供试品主峰的保留时间，应与对照品主峰的保留时间一致。

 2．红外光谱法  《中国药典》中青霉素钠和青霉素钾均采用红外分光光度法进行鉴别，用溴化钾压片后测定，要求供试品的红外吸收光谱与对照的图谱一致。青霉素钠的主要特征峰如下：

   3．焰色反应  照《中国药典》附录“一般鉴别试验”中钠盐和钾盐的火焰反应方法试验。取铂丝，用盐酸湿润后，蘸取供试品，在无色火焰中燃烧，青霉素钠为钠盐，火焰应显鲜黄色；青霉素钾为钾盐，火焰应显紫色。

  二、检查

    1．吸光度  青霉素钠和青霉素钾侧链的苯环有紫外吸收，其水溶液在264nm的波长处有最大吸收，而降解产物在280nm处有最大吸收。测定264nm处的吸光度可以控制青霉素钠的含量，测定280nm处的吸光度，则可以控制杂质的量。

   青霉素钠吸光度的检查方法：取供试品，加水制成每1ml中含1.80mg的溶液，照分光光度法，在280nm与325nm波长处测定吸光度，不得大于0.10；在264nm的波长处有最大吸收，吸光度应为0.80～0.88。

   青霉素钾的分子量较青霉素钠大，检查时需配制每1ml中含1.88mg的溶液，测定吸光度的波长和要求与青霉素钠相同。

   2．青霉素聚合物  青霉素类药物在临床上有时会引起过敏性休克反应，危害极大。多年的研究证明，青霉素类药物引起的过敏性休克反应与药物中的高分子杂质有关。青霉素类药物中的高分子杂质有两类，一类是蛋白(多肽)类杂质，另一类是聚合物类杂质。蛋白(多肽)类杂质是由青霉素的β-内酰胺环开环后与多肽上的伯氨基缩合而成，主要在发酵过程中形成，分子量一般为2400～3500道尔顿。聚合类杂质是由药物分子间发生缩合反应而形成的。药物分子中的β-内酰胺环开环后，产生羧基，羧基可与另一分子上的氨基(母核上或侧链上的)缩合，形成二聚体、三聚体等。聚合物类杂质的抗原性通常较弱，但仍可以作为半抗原，引起速发型过敏反应。

   针对高分子杂质与药物的分子量不同，《中国药典》采用分子排阻色谱法检查聚合物类杂质。青霉素钠中青霉素聚合物的检查方法为：

   色谱条件与系统适用性试验：用葡聚糖凝胶G-10(40～120μm)为填充剂，玻璃柱内径1.0～1.4cm，柱长为30～1000px。以pH7.0的0.1mol/L磷酸盐缓冲液[0.1mol/L磷酸氢二钠溶液-0.1mol/L磷酸二氢钠溶液(61:39)]为流动相A，以水为流动相B；流速为每分钟1.5ml；检测波长为254nm。分别以流动相A、B为流动相，量取0.1mg/ml蓝色葡聚糖2000溶液100～200μl，注入色谱仪，理论板数按蓝色葡聚糖2000峰计算均不低于400，拖尾因子均应小于2.0。在两种流动相系统中蓝色葡聚糖2000峰保留时间的比值应在0.93～1.07之间，对照溶液主峰和供试品溶液中聚合物峰与相应色谱系统中蓝色葡聚糖2000峰的保留时间的比值均应在0.93～1.07之间。另以流动相B为流动相，精密量取对照溶液100～200μl，连续进样5次，峰面积的相对标准偏差应不大于5.0％。

对照溶液的制备：取青霉素对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.1mg的溶液。

测定方法：取本品约0.4g，精密称定，置10ml量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，立即精密量取100～200μl，注入色谱仪，以流动相A为流动相进行测定，记录色谱图；另精密量取对照溶液100～200μl，注入色谱仪，以流动相B为流动相，同法测定。按外标法以峰面积计算，含青霉素聚合物以青霉素计不得过0.08％。

 分子排阻色谱法又称为凝胶色谱法，它使用具有一定孔径的柱填料，被分离组分因分子大小的不同而被分离。本法使用葡聚糖凝胶G-10为固定相，其分离范围为分子量<700，排阻分子量约为1000。分子量>1000的组分不被保留，形成单一的色谱峰先流出色谱柱。青霉素聚合物分子量一般大于1000，不能进入凝胶孔穴，比药物先流出色谱柱，并因此与药物分离。本法以青霉素作为对照品，按外标法计算，限度为0.08％。

青霉素钾也要求检查青霉素聚合物，检查方法和限度与青霉素钠相同。

   3．干燥失重  本品易水解失效，所以应严格控制水分的量。《中国药典》规定，105℃干燥失重不得超过0.5％。

   4．细菌内毒素  本品由微生物发酵制得，易引入细菌内毒素。《中国药典》规定，照附录“细菌内毒素检查法”检查，每1000青霉素单位中含细菌内毒素应小于0.01EU。

  细菌内毒素检查法是利用鲎试剂与细菌内毒素发生凝集反应的机理，来判断供试品中细菌内毒素是否符合规定的方法。细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)来表示。

   5．无菌  青霉素本身有抗菌作用，检查时，取样品，用青霉素酶灭活后或用适宜溶剂稀释后，按《中国药典》附录“无菌检查法”中的“薄膜过滤法”检查，应符合规定。

 6．结晶性  取本品少许，依法检査，应符合规定。

 7．酸碱度  取本品，加水制成每1ml中含30mg的溶液，依法测定，pH 值应为5.0～7. 5。

 8．溶液的澄清度与颜色 取本品5 份，各0.3g，分别加水5ml使溶解，溶液应澄清无色；如显浑浊，与1号浊度标准液比较，均不得更浓；如显色，与黄色或黄绿色1号标准比色液）比较，均不得更深。

 9．有关物质 取本品适量，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含4mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取1.0ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，作为对照溶液；精密量取对照溶液适量，用水定量稀释制成每1ml中约含1.0μg的溶液，作为灵敏度溶液。照高效液相色谱法试验。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾10.6g，加水至1000ml，用磷酸调节pH值至3.4)-甲醇（72:14)为流动相A ，乙腈为流动相B；检测波长为225nm，流速为每分钟1. 0ml，柱温为34℃。取青霉素系统适用性对照品适量，加水溶解并稀释制成每1ml中约含4mg的溶液，取20μl注入液相色谱仪，先以流动相A-流动相B(86.5:13.5 )等度洗脱，待杂质E的第3 个色谱峰（见参考图谱）洗脱完毕后，立即按下表进行线性梯度洗脱，记录的色谱图应与标准图谱一致。取灵敏度溶液20μl注入液相色谱仪，主成分色谱峰峰高的信噪比应大于10。精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl 分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积(1.0 % ) 。供试品溶液色谱图中小于灵敏度溶液主峰面积的峰忽略不计。

 10．可见异物 取本品5份，每份各2.4g，加微粒检査用水溶解，依法检查，应符合规定。（供无菌分装用）

 11．不溶性微粒 取本品3 份，加微粒检査用水制成每1ml中含60mg的溶液，依法检査，每lg样品中，含10μm及10μm以上的微粒不得过6000粒，含25μm及25μm以上的微粒不得过600粒。（供无菌分装用）

三、含量测定

 高效液相色谱法具有分离的功能，专属性更高。青霉素钠的含量测定方法为：

   色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以有关物质项下流动相A-流动相B（70:30）；检测波长为225nm。取青霉素系统适用性对照品适量，加水溶解并稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图应与标准图谱一致。

  测定方法：取本品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约1mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取青霉素对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算，其结果乘以1.0658，即为供试品中青霉素钠(C16H17N2NaO4S)的含量，每1mg青霉素钠(C16H17N2NaO4S)相当于1670青霉素单位。

  由于对照品为青霉素，所以计算结果需乘以1.0658，才为青霉素钠的量。1.0658为青霉素钠的分子量(356.38)与青霉素分子量(334.39)的比值。本法为外标法，含量测定结果的计算公式为：

式中，AX为供试品溶液中青霉素的峰面积；AR为对照品溶液中青霉素的峰面积；WR为对照品的称样量(mg)；WX为供试品的称样量(mg)。

  四、贮藏

  由于青霉素钠不稳定，《中国药典》规定本品的贮藏条件为：严封，在凉暗干燥处保存。

 五、注射用青霉素钠和注射用青霉素钾的分析

   1．注射用青霉素钠  注射用青霉素钠为青霉素钠的无菌粉末。《中国药典》规定，按无水物计算，本品含青霉素钠不得少于96.0％，按平均装量计算，含青霉素钠应为标示量的95.0％～115.0％。

   注射用青霉素钠的鉴别试验与青霉素钠相同；检查的项目有：溶液的澄清度与颜色、青霉素聚合物(≤0.10％)、干燥失重(≤1.0％)、不溶性微粒、酸碱度、细菌内毒素、无菌等。注射用青霉素钠的含量测定方法与青霉素钠相同。

   2．注射用青霉素钾  注射用青霉素钾为青霉素钾的无菌粉末。《中国药典》要求，按无水物计算，本品含青霉素钾不得少于96.0％。

   注射用青霉素钾的鉴别试验和含量测定方法与青霉素钾相同；注射用青霉素钾的检查项目和要求与注射用青霉素钠相同。