体内样品前处理--固相萃取法及其他方法

由于高效液相色谱，尤其是反相高效液相色谱的成功应用，启示人们利用色谱理论，采用装有不同填料的小柱进行体内样品的预处理，而发展了固相萃取（solid-phase extraction，SPE）技术。SPE技术亦称液--固萃取技术，它的应用大大缩短了样品处理时间，同时可避免乳化现象，而且便于自动化操作。

一、固相萃取法（solid-phase extraction，SPE）

（一）SPE原理

将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的体内样品溶液通过小柱时，由于受到“吸附”、“分配”、“离子交换”或其他亲和力作用，药物及内源性物质同时被保留在固定相（填料）上，用适当溶剂洗除干扰物质，再用适当溶剂洗脱药物。

药物的洗脱方式有两种：①一种是药物比干扰物质与固定相之间的亲和力更强，因而在用冲洗溶剂洗去干扰物质时药物被保留，然后用一种对药物亲和力更强的溶剂洗脱药物；②是干扰物质较药物与固定相之间的亲和力更强，则药物被直接洗脱，干扰物质被保留在萃取柱上，使用较多的是前一种洗脱模式。

SPE的填料种类繁多，可分成亲脂型（大孔吸附树脂、亲脂性键合硅胶）、亲水型（硅胶、硅藻土、棉纤维）和离子交换型三类，其中亲脂型用得最多。烷基、苯基、氰基键合硅胶都可用作固相萃取吸附剂，其中十八烷基硅烷键合硅胶（ODS或C18）最常用。亲脂性键合硅胶容易吸附水中的非极性物质，易用有机溶剂洗脱，适用于萃取、净化水基质体液中疏水性药物。常见的商品SPE柱有Sep-Pak C18、Bond-Elut C18、CN（氰基）、C2（乙基）、Ph（苯基）Baker 10 C18等。

（二）SPE操作步骤

使用亲脂性键合相硅胶SPE柱的一般操作步骤如下。

1、活化  用甲醇润湿小柱，活化填料，以使固相表面易于和待测组分发生分子间相互作用，同时可以除去填料中可能存在的干扰物质。

2、溶剂交换（平衡）  用水或适当的缓冲液冲洗小柱，去除过多的甲醇，但冲洗不宜过分。否则会使甲醇含量过低（低于5%），导致C18链弯曲折叠，对待测物的吸附能力下降，造成萃取回收率降低。

3、加样  使体内样品通过小柱，并弃去滤过废液。

4、淋洗  用水或适当缓冲液冲洗小柱，去除吸附于固定相上的内源性物质或其他相关干扰物质。

5、洗脱  选择适当的洗脱溶剂洗脱待测物，收集洗脱液，挥干溶剂备用或直接进行在线分析。

    使用亲脂性键合硅胶SPE柱时，需注意：①体液样品（如血浆等）通过萃取柱的流速控制在1~2ml/min。②冲洗液和洗脱剂的强度、用量要适当，否则会导致药物的损失或洗脱选择性下降。通常选用可与水混溶的洗脱剂。③萃取碱性药物时，洗脱剂中常需加酸、有机胺或氨水、醋酸铵或离子对试剂。

对于大量样品的处理，则有赖于半自动化和全自动化的仪器。半自动SPE是指萃取过程机械化，但将洗脱液转移至进样器则需要手工操作。全自动化仪器是通过柱切换技术实现的，利用切换阀使固相萃取小柱直接联入流路中。

二、超滤法

超滤法（ultrafiltration）是以多孔性半透膜（超滤膜）作为分离介质的一种膜分离技术。通过选用不同孔径的不对称性微孔膜、按照截留分子量的大小，可分离30 ~1000 kD的可溶性生物大分子物质。与通常的分离方法相比，超滤具有不引入化学试剂，没有相态变化，对待测药物的破坏性小等优点。

血液中游离药物的测定可采用分子量截留值在5万左右的超滤膜，用加压（2 kg/cm2）过滤法或用高速离心法将血浆或血清中游离型药物与分子量大的血浆蛋白以及结合了药物的血浆蛋白分离，从超滤液或离心液中得到游离型药物，然后可直接或经浓缩后测定其浓度。

三、缀合物水解

药物或其代谢物与体内的内源性物质结合生成的产物称为缀合物（conjugate）。内源性物质有葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽和醋酸等，特别是前两种为最重要的内源性物质。一些含羟基、羧基、氨基和巯基的药物，可与内源性物质葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸苷缀合物；还有一些含酚羟基、芳胺及醇类药物与内源性物质硫酸形成硫酸酯缀合物。尿中药物多数呈缀合状态。由于缀合物较原形药物具有较大的极性，不易被有机溶剂提取。为了测定尿液中药物总量，需对缀合物进行水解，将缀合物中的药物释出。常用的方法如下：

1．酸水解法  酸水解时，可加入适量的盐酸溶液。酸的用量和浓度、反应时间及温度等条件，随药物的不同而异。这些条件应通过实验来确定。该法比较简便、快速，但有些药物在水解过程中会发生分解；与酶水解法相比，其专一性较差。

2．酶水解法  对于遇酸及受热不稳定的药物，可以采用酶水解法。常用葡萄糖醛酸苷酶（glucuronidase）或硫酸酯酶（sulfatase）。前者可专一地水解药物的葡萄糖醛酸苷缀合物，后者水解药物的硫酸酯缀合物。实际应用中最常用的是葡萄糖醛酸苷酶-硫酸酯酶的混合酶。一般控制pH为4.5~5.5，37℃培育数小时进行水解。

酶水解比酸水解温和，一般不会引起待测物分解，且酶水解专属性强。其缺点是酶水解时间稍长及酶制剂可能带入的黏蛋白导致乳化或色谱柱阻塞。尽管如此，酶水解仍被优先选用。在尿液中采用酶水解，应事先除去尿中能抑制酶活性的阳离子。

3．溶剂解法  缀合物（主要是硫酸酯）往往可通过加入的溶剂在萃取过程中被分解，称作溶剂解（solvolysis）。例如尿中的甾体硫酸酯在pH 1时加醋酸乙酯提取，产生溶剂解，这时的条件也比较温和。

值得注意的是，目前对缀合物的分析逐渐趋向于直接测定缀合物的含量（如采用HPLC和RIA法），以获得在体内以缀合物形式存在的量，以及当排出体外时，缀合物占所有排出药物总量的比率，从而为了解药物代谢情况提供更多的信息。

四、化学衍生化

某些药物或代谢物极性大、挥发性低或对检测器不够灵敏，使用常规的HPLC或GC难以有效测定，需要先进行衍生化反应，然后测定衍生物。药物分子中含有活泼氢者均可被化学衍生化，如含有R–COOH、R–OH、R–NH2、R–NH–R′等官能团的药物都可进行衍生化。