高效液相色谱法和气相色谱法

一、概述

高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)，系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。 注入的供试品由流动相带入色谱柱，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。高效液相色谱法具有分离效能高、分析速度快、应用范围广等特点，是在药品检验中应用非常广泛的一种仪器分析方法。按色谱分离机制，高效液相色谱法可以分为吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法与分子排阻色谱法等；按固定相的物态，可以分为液-固色谱法(LSC)和液-液色谱法(LLC)。

二、高效液相色谱仪

1．高压输液泵  用于输送流动相。要求流量恒定且可以自由调节，耐高压，耐腐蚀，适于梯度洗脱等。

2．色谱柱  用于组分的分离。色谱柱系由柱管和固定相组成，采用匀浆法高压装柱。按规格可分为分析型和制备型两种，常量分析型柱内径2～5mm，长10～750px，半微量分析型柱内径1.0～1.5mm，长10～500px。

3．进样阀  用于将供试品溶液注入色谱柱。目前使用的均为六通进样阀，使用六通进样阀可以在不中断流路、带压情况下直接进样，还可配不同容积的样品环(简称定量环)，可按需要更换。进样阀的进样量准确、重复性好。

4．检测器  是将流动相中组分浓度变化转变成电信号变化的装置。检测器要求灵敏度高、噪音低、线性范围宽、重复性好。最常用的检测器是紫外检测器，其他常见的检测器有光二极管阵列检测器、荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器和质谱检测器等。

高效液相色谱仪示意图

三、分离原理

分配色谱法的分离原理系利用被分离组分溶入互不相溶的固定相和流动相，并达到平衡后的浓度之比(分配系数)的差别而被分离。

按照固定相和流动相极性的相对大小，分配色谱法又可分为正相分配色谱法和反相分配色谱法。

1．正相分配色谱法  系指流动相极性小于固定相极性的分配色谱法，简称为正相色谱法。在正相色谱法中，极性小的组分由于K值较小，所以先流出，极性大的组分后流出。正相色谱法用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质。

2．反相分配色谱法  系指流动相极性大于固定相极性的分配色谱法，简称为反相色谱法。在反相色谱法中，极性强的组分因K值较小而先流出色谱柱，极性弱的组分后流出。反相色谱法是应用最广泛的高效液相色谱法，主要用于分离非极性至中等极性的各类分子型物质。

最常用的固定相是化学键合相(简称为键合相)，系通过化学反应将固定相的官能团键合在固体载体表面而成。目前，常用的化学键合相按其极性可分为非极性键合相和极性键合相。非极性键合相常用的有十八烷基硅烷键合硅胶(Octadecylsilane，ODS或C18)和辛基硅烷键合硅胶(C8)等，适用于反相色谱法。其中，ODS是反相色谱法中最为常用的固定相。极性键合相  常用氨基和氰基硅烷键合相，既可以用于正相色谱法，也可用于反相色谱法。

  四、色谱系统适用性试验

  色谱系统适用性试验系指用规定的对照品对色谱系统进行试验，应符合要求。如达不到要求，可对色谱分离条件作适当的调整。色谱系统适用性试验通常包括：理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个指标。其中，分离度和重复性是系统适用性试验中更具实用意义的参数。

  (一)色谱柱的理论板数(n)

  在选定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主要成分峰或内标物质峰的保留时间tR(以分钟或长度计，下同，但应取相同单位)和半高峰宽(Wh/2)，按下式计算色谱柱的理论板数：

n=5.54(tR/Wh/2)2

  (二)分离度(R)

  无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。分离度的计算公式为：

式中，为相邻两峰中后一峰的保留时间；为相邻两峰中前一峰的保留时间；W1及W2为此相邻两峰的峰宽。

 除另有规定外，定量分析时分离度应大于1.5。

 (三)重复性

  取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0％。也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80％、100％和      120％的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成三种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子，其相对标准偏差也应不大于2.0％。

                   分离度计算示意图                         拖尾因子计算示意图

 (四)拖尾因子(T)

  为保证分离效果和测量精度，应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定。拖尾因子计算公式为：                                

式中，W0.05h为5％峰高处的峰宽；d1为峰顶点至峰前沿之间的距离。除另有规定外，峰高法定量时T应在0.95～1.05之间。峰面积法测定时，T值偏离过大，也会影响小峰的检测和定量的准确度。

  五、应用

  (一)在鉴别中的应用

  常利用保留值进行鉴别。即在相同的色谱条件下，分别取供试品溶液和对照品溶液进样，记录色谱图，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液的一致。

 (二)在杂质检查中的应用

  《中国药典》采用以下方法检查杂质：

  1．内标法加校正因子测定供试品中某个杂质的含量  按各品种项下的规定，精密称(量)取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：

                                                          (6-15)    

式中，AS为内标物质的峰面积或峰高；AR为对照品的峰面积或峰高；CS为内标物质的浓度；CR为对照品的浓度。

  再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品溶液中待测杂质和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：

式中，AX为供试品中待测组分的峰面积或峰高；CX为供试品中待测组分的浓度；f、AS和CS的意义同上。

当配制校正因子测定用的对照溶液和含有内标物质的供试品溶液，使用等量同一浓度的内标物质溶液时，则配制内标物质溶液时不必精密称(量)取。

  2．外标法测定供试品中某个杂质的含量  按各品种项下的规定，精密称(量)取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图。测量对照品溶液和供试品溶液中待测杂质的峰面积(或峰高)，按下式计算含量：

式中，各符号意义同上。

  3．加校正因子的主成分自身对照法  用于测定杂质含量。在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称(量)取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按上述1法计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各品种正文中，用于校正杂质的实测峰面积。

  测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液，进样，调节仪器灵敏度(以噪音水平可接受为限)或进样量(以色谱柱不过载为限)，使对照溶液的主成分峰高达满量程的10％～25％或其峰面积能准确积分〔通常含量低于0.5％的杂质，峰面积的相对标准偏差(RSD)应小于10％；含量在0.5％～2％的杂质，峰面积的RSD应小于5％；含量大于2％的杂质，峰面积的RSD应小于2％〕。然后，取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样，供试品溶液的记录时间除另有规定外，应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含量。

 4．不加校正因子的主成分自身对照法  当没有杂质对照品时，也可采用不加校正因子的主成分自身对照法。同上述3法配制对照溶液并调节仪器灵敏度后，取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样，前者的记录时间除另有规定外，应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，并与对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质含量。 若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离，则按规定先记录供试品溶液的色谱图Ⅰ，再记录等体积纯溶剂的色谱图Ⅱ。色谱图Ⅰ上杂质峰的总面积(包括溶剂峰)，减去色谱图Ⅱ上的溶剂峰面积，即为总杂质峰的校正面积。然后依法计算。

  5．面积归一化法  测量各杂质峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各杂质峰面积及其之和占总峰面积的百分率。由于峰面积归一化法误差较大，因此，通常只能用于粗略考察供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。

 (三)在含量测定中的应用

  含量测定方法同(二)在杂质检查中的应用项下的方法1和方法2，即内标法和外标法。 1．内标法加校正因子测定供试品中主成分的含量  测定方法和计算公式同(二)在杂质检查中的应用项下的方法1。

对内标物的要求：①原样品中不含有的组分；②其保留时间与待测组分相近，但能完全分离(R≥1.5)；③必须是纯度合乎要求的纯物质。

  2．外标法  测定方法和计算公式同(二)在杂质检查中的应用项下的方法2。

六、气相色谱法

气相色谱法(gas chromatography，GC)系采用气体流动相(载气)流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。待测组分或其衍生物气化后，被载气带入色谱柱进行分离，各组分先后进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。气相色谱法具有分离效能高、灵敏度高、样品用量少、分析速度快等优点，但受样品蒸气压限制，不适用于难挥发和热稳定性差的物质的分析。

色谱系统适用性试验应照高效液相色谱法项下的规定。含量测定方法可采用内标法、外标法和标准溶液加入法。其中，内标法和外标法的内容均同高效液相色谱法项下相应的规定；标准溶液加入法的内容同在杂质检查中的应用项下。