实时荧光定量PCR技术

    常规PCR扩增产物是通过琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色、紫外光观察结果，或者通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染检测，这不仅需要多种仪器设备，而且费时费力，所使用的染色剂溴化乙锭和丙烯酰胺等物质对人体又有害；这些繁杂的实验过程还给污染和假阳性提供了机会。如果能在PCR扩增结束后不打开反应管盖即可实现扩增产物的检测，就可以克服常规PCR扩增的这些缺点。在此基础上，美国Perkin Elmer公司于1995 年开发了实时荧光定量PCR技术。该技术是一种核酸定量技术，通过对荧光信号的检测，实现了对PCR过程中产物量的实时监测，并可以精确计算出PCR的初始模板量。因此，被广泛应用于生物病原体检测、突变检测和多态性分析。实时荧光定量PCR只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，无需PCR后处理，无须对样品进行电泳，直接对反应管内的扩增产物进行检测；具有操作简单、速度快等优点。近年来，基于这一检测原理，通过设计各种形式的探针，发展了多种检测SNP的技术，如TaqMan探针技术、分子信标技术和高分辨率溶解曲线检测技术等。

    TaqMan探针技术[1]是由美国Perkin Elmer公司于1995年开发的一种核酸定量技术，也是最早发展的一种实时荧光定量PCR技术。探针的5′-末端和3′-末端分别标记荧光基团和淬灭基团，两者能发生荧光共振能量转移而不产生荧光。在PCR反应过程中，Taq酶的5′-核酸外切酶活性将与DNA模板结合的探针降解，使得荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。因此，可以通过检测PCR过程中或PCR之后产生的荧光信号来实现DNA模板的定量。目前，该技术已被广泛用于SNP的检测。

                                    TaqMan探针技术测定SNP的原理

 分子信标技术（Molecular beacons）是Tyagi等在1996 年根据荧光共振能量转移现象首次成功设计的，由于这种技术在单碱基变异检测中显示出了非常高的特异性，两年之后，他们将这种技术应用到了SNP检测中。分子信标探针技术具有PCR 技术的高效核酸扩增特性、核酸探针杂交的高特异性，以及荧光技术的高灵敏性和可计量性。目前，分子信标法已被广泛应用于基因变异研究、病原微生物的检测和肿瘤研究等多个领域。随着对分子信标特性研究的深入及新型分子信标的出现，人们发现分子信标作为一种核酸探针，不仅适用于体外核酸分析，而且也适用于活体分析。此外，该技术还可以用于蛋白质等能与核酸发生相互作用的物质分析，是一种极好的研究蛋白质与核酸的工具。

分子信标技术检测SNP的原理

 高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting, HRM）技术是在熔解曲线法的基础上发展起来的一种可用于检测SNP的新技术。该技术不需要标记探针就可以快速准确地对SNP进行分型；还可用于短片段重复序列的分析、序列匹配、突变扫描、甲基化和RNA编辑等方面的研究。该技术既可用于未知SNP的分析，也可用于已知SNP的检测。高分辨率熔解曲线分析技术筛查未知SNP的原理如图13-3所示，即通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况来实现。在PCR 反应时引入饱和荧光染料，荧光染料在PCR 扩增的过程中嵌入到DNA双链中。当嵌有染料的DNA 分子解链的时候，仪器对荧光信号进行采集，绘制出DNA分子的熔解曲线。如果存在SNP 位点，则会产生SNP 位点不匹配的异源双链DNA，该双链DNA在升温过程中会先解开，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，呈现出不同的熔解曲线形状及熔解温度（Tm值），通过专业的分析软件可以快速确定是否存在SNP。

高分辨率熔解曲线分析技术筛查未知SNP的原理

A：原始熔解曲线，B：归一化后的熔解曲线。