第二节  血细胞生理 

一、红细胞生理 

（一）红细胞的形态、数量与功能 
1.红细胞的形态  正常成熟红细胞的形态呈双凹圆碟形，直径约7～8μm，无细胞核和细胞器，中间薄，周边厚。
2.红细胞的数量  我国成年男性红细胞数量为(4.0～5.5) ×1012/L；成年女性为(3.5～5.0)×1012/L；新生儿可高达6.0×1012/L。

红细胞内的蛋白质主要是血红蛋白（Hb）。我国成年男性血红蛋白浓度为120～160g/L；成年女性为110～150g/L；新生儿可达200g/L。血液中红细胞数量和血红蛋白浓度低于正常，称为贫血。 
3.红细胞的功能  红细胞的主要功能是运输O2和CO2。此外，还能缓冲血液酸碱度变化。这些功能都是靠血红蛋白实现的。血红蛋白只有存在于红细胞内才能发挥作用，一旦红细胞破裂，血红蛋白逸出到血浆，即丧失其功能。 
（二）红细胞的生理特性 
1．可塑变形性：正常红细胞在外力作用下具有变形的能力，这种特性称为可塑变形性。红细胞在全身血管中循环运行时，须经过变形才能挤过口径比它小的毛细血管和血窦孔隙，红细胞在通过后又会恢复原状。 

2．悬浮稳定性：红细胞能相对稳定地悬浮于血浆中而不易下沉的特性，称为红细胞的悬浮稳定性。临床上常用红细胞沉降率（简称血沉，ESR）表示。即将装有抗凝血的血沉管垂直静置，记录红细胞在第一小时末下沉的距离。用魏氏法测定，正常成年男性为0～15mm/h，成年女性为0～20mm/h。沉降率愈快，表示红细胞悬浮稳定性愈小。红细胞在血浆中具有悬浮稳定性，是由于红细胞与血浆之间的摩擦阻碍了红细胞的下沉。在某些疾病时（如风湿热、活动性结核病等）血沉加快，主要是由于多个红细胞彼此能较快地以凹面相贴，称为红细胞叠连；叠连以后，红细胞与血浆的摩擦力减小，于是血沉加快。故血沉测定可作为临床的一种辅助检查手段。 

3．渗透脆性：红细胞在低渗盐溶液中发生膨胀破裂的特性称为红细胞的渗透脆性（简称脆性）。红细胞在等渗的0.9%NaCl溶液中可保持正常大小和形态。实验证明，正常人红细胞在0.8%-0.6%NaCl溶液中，会逐渐胀大但不发生破裂溶血，在0.42%NaCl溶液中部分红细胞开始破裂溶血，在0.35%NaCl溶液中全部红细胞破裂溶血。这一现象表明红细胞对低渗盐溶液具有一定的抵抗力。红细胞的抵抗力大小与其脆性呈反变关系。抵抗力大则脆性小，红细胞不易破裂；反之亦然。衰老或病理状况下的红细胞脆性大，新生的红细胞脆性小。 
（三）红细胞的生成与破坏 
1.红细胞的生成部位及演变 
人出生后红骨髓是生成红细胞的唯一场所。若骨髓造血功能受到放射线、药物等理化因素的抑制，三种血细胞和血红蛋白均减少，称为再生障碍性贫血。红细胞在发育过程中，体积由大变小，细胞核逐渐消失，细胞内血红蛋白逐渐增多。 
2.红细胞生成所需物质 
（1）造血原料：蛋白质和铁是合成血红蛋白的基本原料。正常膳食能保证蛋白质供给。因某种原因引起蛋白质缺乏时，可致血红蛋白合成减少而引起贫血，称为营养不良性贫血。成人每日需20～30mg铁用于红细胞的生成，其中95%来自于体内血红蛋白分解后释放出的铁的再利用；其余5%由食物提供。当铁摄入不足或吸收障碍，或长期慢性失血，可使血红蛋白合成减少，引起小细胞低色素性贫血，即缺铁性贫血。 
（2）成熟因子：维生素B12和叶酸是红细胞发育成熟过程中不可缺少的成熟因子。两者均为合成DNA前身物质的重要辅酶。当缺乏叶酸或维生素B12时，红细胞体积增大，导致巨幼红细胞性贫血。食入的维生素B12需要与胃腺壁细胞分泌的内因子结合形成复合物，才能在回肠被吸收，故内因子缺乏也可引起巨幼红细胞性贫血。 
3.红细胞生成的调节  
红细胞的生成主要受促红细胞生成素和雄激素的调节。 
（1）促红细胞生成素（EPO） 主要在肾脏合成。组织缺氧是促进EPO分泌的生理性刺激因素。缺氧时，促红细胞生成素释放增多，使血中成熟红细胞增加。当红细胞数量增加，机体缺氧缓解，肾分泌促红细胞生成素则减少，这一负反馈调节使血中红细胞数量能保持相对稳定。 
（2）雄激素  既可直接刺激骨髓造血功能，又可刺激肾产生促红细胞生成素，使红细胞生成增多。青春期后，男性红细胞数量高于女性的原因就在于此。临床上可用雄激素治疗贫血。 
4.红细胞的破坏  
红细胞的平均寿命为120天。衰老红细胞变形性差且脆性增大，难以通过微小的孔隙，因此容易滞留于脾和骨髓中而被巨噬细胞所吞噬。此外，还有10%的衰老红细胞在血管中受机械撞击而破损。肝、脾是红细胞破坏的主要场所，脾功能亢进时，红细胞破坏增加，引起脾性贫血。 

二、白细胞生理 

（一）白细胞分类与数量 
     正常成人白细胞总数为（4.0～10.0）×109/L，新生儿白细胞总数可达（12.0～20.0）×109/L。白细胞胞可分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞五类。各类白细胞的正常值。 

 （二）白细胞的功能 
     各类白细胞均参与机体的防御功能。白细胞所具有的变形、游走、趋化、吞噬和分泌等特性是执行防御功能的生理基础。 
1．中性粒细胞  中性粒细胞的主要功能是吞噬和杀灭入侵的病原微生物，吞噬和清除衰老的红细胞，吞噬抗原抗体复合物。在非特异性免疫中，中性粒细胞总是处于机体抵抗病原微生物，尤其是急性化脓性细菌入侵的第一线。临床上白细胞总数增多和中性粒细胞百分率增高，常提示为急性化脓性细菌感染。 
2．单核细胞  单核细胞在血液中吞噬能力较弱，在血液中停留2～3天后穿过血管壁进入组织，继续发育成巨噬细胞，其吞噬能力大大增强。单核—巨噬细胞的主要功能是：①吞噬细菌和异物；②识别和杀伤肿瘤细胞；③参与激活淋巴细胞的特异性免疫功能等。 
3．嗜酸性粒细胞  嗜酸性粒细胞的主要作用与过敏反应有关：①能抑制嗜碱性粒细胞合成和释放组胺等生物活性物质，故可限制嗜碱性粒细胞在过敏性反应中的作用；②参与对蠕虫感染的免疫反应。嗜酸性粒细胞可粘附在蠕虫体上，并杀伤蠕虫。患过敏性疾病或某些寄生虫病时，嗜酸性粒细胞增多。 
4．嗜碱性粒细胞  嗜碱性粒细胞能合成并释放组胺、过敏性慢反应物质、肝素和嗜酸性粒细胞趋化因子等。主要作用有：①组胺、过敏性慢反应物质具有使小血管扩张，毛细血管壁通透性增加，支气管平滑肌收缩，引起荨麻疹、哮喘等过敏反应症状；②肝素具有抗凝血作用；③嗜酸性粒细胞趋化因子能吸引嗜酸性粒细胞聚集于过敏反应的局部，以限制嗜碱性粒细胞在过敏反应中的作用。 
5．淋巴细胞  淋巴细胞参与机体的特异性免疫功能。淋巴细胞分为T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞（NK）三大类。T细胞主要与细胞免疫有关；B细胞主要与体液免疫有关；NK细胞则是机体天然免疫的重要执行者。 

三、血小板生理 

      血小板是骨髓中成熟巨核细胞胞浆裂解脱落下来的细胞质碎片，平均寿命为7-14天。血小板体积小，无细胞核，呈双面微凸的圆盘状，直径为2-3μm。 
（一）血小板的数量 
正常成人血小板数量为(100～300)×109/L。剧烈运动后及妊娠中、晚期升高；月经期减少。 
（二）血小板的生理特性 
1．粘附 血小板与非血小板表面的粘着，称为血小板粘附。当血管内皮损伤暴露出内膜下胶原组织时，血小板便粘附于胶原组织上。血小板不能粘附于正常内皮细胞的表面。 
2．聚集 血小板与血小板之间的相互粘着，称为血小板聚集。 
3．释放 血小板受刺激后，将储存在颗粒中的活性物质向外排出的现象，称为血小板释放或血小板分泌。主要有ADP、ATP、5-羟色胺（5-HT）等。释放出的活性物质有助于小血管收缩、止血和凝血。 
4．吸附 血小板表面能吸附血浆中多种凝血因子。当血管破损时，血小板粘附、聚集于破损部位，可吸附大量凝血因子，使局部凝血因子浓度升高，有利于凝血和止血。 
5．收缩 血小板内有收缩蛋白，受刺激时可发生收缩，使血凝块回缩和血栓硬化，有利于止血。 
（三）血小板的生理功能 
1.维持血管内皮完整性  动物实验显示，血小板能够粘附并融合到血管内皮中，以填补血管内皮损伤形成的空隙，及时修补血管壁，从而维持毛细血管壁的正常通透性。当血小板数量低至50×109／L时，患者毛细血管通透性增大，微小创伤即可使之破裂而出现皮肤及粘膜下出血点或紫癜。
2.参与生理性止血  正常情况下，小血管受损后引起的出血，数分钟后出血自行停止的现象称为生理性止血。生理性止血过程主要包括血管收缩、血小板血栓形成和血液凝固三个过程。在生理性止血过程中，血小板发挥的作用是：①血小板释放的缩血管物质（如5-HT），使受损血管收缩，裂口缩小。②血小板粘附聚集形成较松软的血小板血栓，进行初步止血。③血小板释放凝血因子，同时激活凝血系统，参与血液凝固，形成血凝块，达到有效止血。 

临床上用小针刺破耳垂或指尖，使血液自然流出，测定出血延续的时间，称为出血时间，正常值为1～4分钟。若血小板数量减少或功能障碍，出血时间延长。

3.促进血液凝固  血小板含有多种与凝血有关的物质，统称为血小板因子，如血小板第三因子（PF3），能提高凝血酶原激活速度和加速血液凝固进程。

诱导多能干细胞

一、干细胞的基本概念     干细胞（stem cells, SC）是一类具有自我更新和多向分化潜能的原始未分化细胞。干细 胞具有的无限制自我更新能力的特性使其可在合适的体外培养条件下不断增殖；所具有的多 向分化的潜能表明干细胞可经诱导分化成各种类型的体细胞。这两个特性使干细胞可用于细 胞替代，组织修复，器官再生，基因治疗等多个方面，为目前多种临床上难以治疗的重大疾 病提供了一种新的治疗方法，在医学上具有广泛的应用前景。由于干细胞是一种未充分分化， 尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称之为“万用细胞”。
     1．干细胞的界定标准  界定一个细胞是否是干细胞，有 4 条标准：①干细胞可进行多 次的、连续的、自我更新式的细胞分裂，这是维持群体稳定的一个首要条件。②起源于单一 干细胞的子细胞可分化出超过 1 种以上的细胞类型。例如，造血干细胞（hematopoietic stem cells, HSC）可分化成所有的血细胞；神经干细胞（neural stem cells, NSC）可分化为神经元、 神经胶质细胞和少突起细胞；间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）可分化为纤维 母细胞、成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞。有些成熟干细胞只能分化成单一一种成熟的细 胞类型，例如角膜干细胞。③当干细胞被移植入损伤的受者体内时，它能重建原来组织的功 能，这一点已被造血干细胞证实。最近发现肝的原始细胞和神经干细胞也显示此特点。④即 使无组织损伤，干细胞也能在体内分化扩增。胚胎干细胞能完全符合上述标准。胚胎干细胞 能以一种不确定的未分化状态扩增。将其注入胚泡中，胚胎干细胞能生成所有类型的细胞。
     2．干细胞的分类  干细胞有两种分类方法，一是根据干细胞的分化能力分为全能干细 胞（totipotent stem cell, TSC）、多能干细胞（ pluripotent stem cell）和单能干细胞（unipotent stem cell）三类；二是根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞（embryonic stem cell）和成体 干细胞（somatic stem cell 或 adult stem cells）。全能干细胞具有形成完整个体的分化潜能多 能干细胞具有分化为多种细胞、组织的潜能，如胚胎干细胞。多能干细胞具有分化为多种细 胞、组织的潜能，但丧失发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制，如造血干细胞。 单能干细胞也称专能干细胞（committed stem cell） ，只能向一种类型或密切相关的 2 种类型 的细胞分化。如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的卫星细胞。干细胞在分化为特化细胞之 前常产生一种或几种祖细胞，然后由祖细胞分化产生特化细胞。     胚胎干细胞（embryonic stem ce11s, ES）是指当受精卵分裂发育成囊胚时内细胞团的细 胞，发育等级较高，可以分化出内、中、外 3 个胚层的所有细胞，进一步形成机体的所有组 织、器官，并且在体外培养时也可以保持未分化状态，是全能干细胞。成体干细胞存在于成 体组织，包括造血干细胞、脐带血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、脂肪干细胞、 心肌干细胞等，发育等级较低，是多能或单能干细胞。成年动物的许多组织和器官具有修复 和再生的能力，成体干细胞在其中起着关键作用。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的 干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的 动态平衡。     3．成体干细胞与胚胎干细胞的比较  与胚胎干细胞相比较,成体干细胞有以下几个特 点：①成体干细胞数量很少，其基本功能是参与组织更新，创伤修复及维持机体内环境稳定。 研究表明，每 10 000～15 000 个骨髓细胞中只有一个造血干细胞，成体哺乳动物脑内的干细 胞数量极少，仅占室下带区中相对静止数的 0.1%～1%。②成体干细胞常以特定的微环境 （nich）为居住环境，其生物学特性受微环境的影响与制约。所谓微环境是指存在于干细胞 所处的细胞基质中，对干细胞命运（是增殖还是分化）起调控作用的各种信号分子（生长因 子及其受体、激素及介导分子）的总称。成体干细胞是自我复制还是分化为功能细胞取决于 所在的微环境和自身的功能状态。③成体干细胞不象胚胎干细胞（来源于内细胞团）那样有 确定的来源。目前仍不能确定不同组织干细胞的发源地。有学者推测，成体干细胞是胚胎发 育过程中保存下来的未分化的细胞，这提示成体干细胞与胚胎干细胞可能会有更多的相似性 和同源性。     此外，除上述生物学特性差异外，在应用上成体干细胞与胚胎干细胞也有不同优势。虽 然胚胎干细胞几乎可以向所有的成年组织分化，但人的胚胎细胞受到伦理学问题和取材困难 等因素的限制，因此，对胚胎干细胞的研究主要是通过动物实验进行。成体干细胞存在于胎 儿和成人各种组织及器官中，来源广泛，而且不涉及伦理问题。若采用胚胎干细胞诱导分化 的细胞和组织应用于患者进行细胞和组织替代性治疗，相当于异体移植，存在免疫排斥的问 题，而且胚胎干细胞能否分化为肿瘤样的组织，尚是个未知数。成体干细胞可取自于患者的 自身组织如骨髓和外周血等，定向诱导分化后移植回输给患者，不存在免疫排斥的问题。因 此，成体干细胞在临床应用方面可能有更广阔的前景。     4．肿瘤干细胞  肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞被称作肿瘤 干细胞（tumor stem cell, TSC） 。传统观念认为，肿瘤是由体细胞突变而成，每个肿瘤细胞都 可以无限制地生长。但这无法解释肿瘤细胞似乎具有无限的生命力以及并非所有肿瘤细胞都 能无限制生长的现象。但近几年提出的肿瘤干细胞假说认为，在所有的细胞中，只有很小一 部分细胞具有形成并维持肿瘤生长和异质性的能力，这一小部分细胞被称作肿瘤干细胞。肿 瘤干细胞与干细胞具有很多相似的特点，如二者都就具有自我更新、可以产生大量分化细胞 以及拥有一些共同的细胞表面抗原标记，但干细胞在有序的调控下发挥自己的功能，而肿瘤 干细胞分裂与分化是失控的，通过不断自我更新与分化，最终产生大量的肿瘤细胞，维持着 肿瘤的生长与异质性。目前对于肿瘤干细胞的起源尚未阐明。目前认为肿瘤干细胞可能来源 于干细胞的累计突变或来源于祖细胞的突变后获得自我更新能力。传统对待癌症的治疗模式 是通过手术切除、化疗、放疗等方法，消灭大部分的癌细胞，但是如果占据总细胞数很小比 例的肿瘤干细胞依然存在，即使其他大部分肿瘤细胞已经被消灭，癌症的复发依然会发生。 因此，彻底地根除癌症需要首先消灭肿瘤干细胞，发展只针对肿瘤干细胞的药物及治疗方法 对癌症的临床治疗具有重要意义。

二、诱导多能干细胞     诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS）是指利用外源导入基因或化学物的 方式，诱导已经分化成熟的体细胞逆向形成的具有胚胎干细胞性质的多能性细胞。虽然人类 胚胎干细胞（ES）和人类诱导多能干细胞都拥有分化为不同类型干细胞的能力，但与 ES 细 胞相比，iPS 可通过人类体细胞的“重设”获得，且 iPS 细胞获得的方法更简便，并不受伦理 道德因素的约束。因此，被认为是非常有用的研究工具，在再生医学中有着巨大的潜力。    

（一）诱导多能干细胞产生的背景 
 
    iPS 细胞技术的建立有赖于三个相关领域前期进展。第一个有赖于对核移植的重编程研 究。早在 1938 年，实验胚胎学先驱 1935 年获得诺贝尔生理学和医学奖者汉斯·斯佩曼（Hans Spemann）和他的学生就发现把发育早期的蝾螈细胞核移植到去除了细胞核的发育晚期蝾螈 胚胎中，胚胎细胞可以继续发育成为一个完整的蝾螈。1962 年，约翰·格登（John Gurdon） 报道，把美洲爪蟾的小肠上皮细胞核注入去核的卵细胞，结果发现一部分卵依然可以发育成 蝌蚪，其中的一部分蝌蚪可以继续发育成为成熟的爪蟾，首次实现将成体细胞发育成一个完 整个体。1997 年伊恩·维尔穆特（Ian Wilmut）羊乳腺细胞核转入到去核的卵细胞，成功 获得克隆羊多莉，这是通过哺乳类体细胞克隆产生的首个哺乳类动物。这些研究证明，即 使已经分化的细胞也含有整个生物体发育所需要的遗传信息，卵母细胞含有可以重编程体细 胞核的因子。以往的遗传学认为，哺乳动物体细胞的功能是高度分化了的，不可能重 新发育成新个体。但约翰·格登和伊恩·维尔穆特的研究彻底推翻上述理论，实现了遗传学 的重大突破。
  1935 年诺贝尔奖获得者汉斯·斯佩曼 （Hans Spemann）（1869～1841） 伊恩·威尔穆特（Ian Wilmut）和他的克隆绵羊     第二个相关前期进展是发现“主控的”转录因子。1987 年，科学家证明果蝇转录因子 ——触角腿基因（Antennapedia）异位表达时会诱导腿而非触角的形成。同年，证明哺乳动 物转录因子 MyoD 将成纤维细胞转换为肌细胞。这些结果形成了“主控的调节因子”概念， 该转录因子决定并诱导细胞谱系的命运。许多研究人员开始寻找各谱系起主导作用的单个调 节因子。这些尝试除了少数获得成功之外，大多都以失败告终。     第三相关前期进展涉及 ES 细胞，1981 年第一代小鼠 ES 细胞 建系之后，Austin Smith 等确立了能够长期维持干细胞多能性的体外培养条件。     核移植技术本质上是一种把成年的细胞变成有多种分化能力的细胞的过程，格登等人的 工作显示，既然一个普普通通的体细胞都可以发育成为一个完整的个体。那么可以想象，一 定存在某种途径可以让这个细胞通过连续的分化有可能让它变成心肌细胞、骨骼细胞、牙齿 细胞或者其他那些身体所拥有的细胞，而且这些细胞取自患者本人，无需考虑来自其他人的 细胞或者器官所带来的可能致命的免疫排斥作用，一副多么美妙的再生医学画卷展现在了人类的面前。可惜实际操作并没有那么简单，长期以来在技术上和研究策略上并无突破。日本 科学家山中伸弥（Shinya Yamanaka）结合前两个的前期相关研究提出这样一种假设：卵母 细胞或 ES 细胞中存在一种多个因子的组合，这种组合可以将体细胞重编程回到胚胎状态。 为此，他们通过对 24 种可能对逆分化产生作用的转录因子进行筛选，成功地利用逆转录将 4 种转录因子 Oct4、sox2、klf4、cmyc 基因子（这 4 个因子也被称为 Yamanaka 因子）导入小 鼠胚胎成纤维胎鼠成纤维细胞细胞和小鼠尾尖成纤维细胞诱导形成具有与胚胎干细胞的细 胞形态、生长特性、表面标志物高度相似的诱导多能干细胞（iPS） 。2007 年，Takahashi 等 将人皮肤成纤维细胞重编程为 iPS 细胞，揭开了人体细胞重编程的序幕。2012 年约翰·格登 和山中伸弥因为在细胞核重新编程研究领域所作出的杰出贡献而获得诺贝尔生理学和医学 奖。
     （二）诱导多能干细胞研究进展     许多研究表明，从任何一个胚层发育分化而来的细胞都可重编程成为 iPS 细胞，而且不 同阶段的细胞重编程的难易程度是不同的，在间充质干细胞等分化程度较低的细胞在诱导过 程中重编程难度比已处于终末分化的体细胞要容易。由于 iPS 的重大理论价值和在再生医学 中的巨大潜力，激起了全球 iPS 研究热潮，取的了快速的发展。     1．减少因子和提高效率  在山中伸弥虽成功地建立了 iPS 细胞，但是 iPS 细胞产生的 效率很低，只有约 0.01%左右，另 6 一方面，山中伸弥所采用的 Oct4、sox2、cmyc、ldf4 四 种基因中，c-Myc 和 Klf 等为癌基因，这些基因的过表达，尤其是 c-Myc 基因的激活将导 致小鼠 iPS 细胞具有高度致瘤性。虽然 Yamanaka 等（2008）用除 c-Myc 外的其他 3 种因子 同样可获得 iPS 细胞，但该方法却使细胞的诱导效率大幅下降。由此，如何既能保证 iPS 细 胞诱导的安全性又能提高诱导效率遂成为研究的重点。     （1）优化诱导因子：Robert Blelloch 等观察到采用低成瘤性的 n-Myc 可以替代 c-Myc 诱导 iPS 细胞，为无需抗癌性基因的筛选迈出了实用的一步。采用 Essrb 替代 c-Myc 和 Klf4 这两个潜在的致癌因子，与 Oct4 和 Sox2 共同作用可有效地把胎鼠成纤维细胞重编程为 iPS 细胞。为了减少诱导因子的数量，有些实验室利用某些体细胞可以自身较高表达某些的内源 因子的特点，如神经干细胞和神经前体细胞可表达 Sox2，通过外源表达 Oct4 和 Klf4 两个因子就可以诱导，形成 iPS 细胞。此后，Kim 小组还继续简化导入因子的数目，发现仅运用 Oct4 就足以将神经干细胞重编程为 iPS 细胞。     （2）加用小分子化合物：许多研究发现，在诱导 iPS 细胞过程中导入一些小分子化合 物不但可促进细胞重编程，甚至可取代某些转录因子的作用。BIX-01294（组蛋白甲基转移 酶 G9a 的抑制剂）是最早发现可替代 Oct4 诱导神经干细胞重编程为 iPS 细胞的小分子化合 物。Jaenisch 等发现可溶性细胞内信号分子 Wnt3a 亦可替代原癌基因 c-Myc，使得 Oct4，Sox2 和 Klf4 三个因子就可诱导胎鼠成纤维细胞形成 iPS，并提高重编程效率。此外，一些小分子 化合物不仅可减少转录因子的使用，同时可提高转录效率。如 Huangfu 等报道，Oct4 和 Sox2 两种因子与组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸（VPA）组合运用可将人皮肤成纤维细胞重编程 为 iPS 细胞。在 L型钙通道拮抗剂 BayK8644 的作用下，只需导入 Oct4 和 Klf4 就可将小鼠 胎儿成纤维细胞（MEF）诱导为 iPS 细胞。这些结果表明，采用外源性分子取代插入基因组 后可能引起突变的内源性基因，将是提高 iPS 细胞安全性的有效途径之一。     （3）采用蛋白质诱导多能干细胞：由于转录因子在基因组上整合的不确定性，很可能 激活原癌基因或抑制抑癌基因，为此推进了寻找新型诱导因子的研究。2009 年丁盛等报道， 在细胞穿膜肽的协助下直接将转录因子编码的蛋白导入小鼠胚胎成纤维细胞 MEF，可取代 基因诱导使之转变为可长期自我更新的蛋白诱导多能干细胞。Kim 等将这项技术应用于人体 细胞，诱导出 iPS 细胞。这一方法避免了 DNA 转染，病毒及对细胞具有潜在有害作用的化学 物质的使用，安全性高，被誉为干细胞领域的二次革命。但该方法大大降低了 iPS 细胞的生 成率，技术上有待进一步改进。     （4）采用 RNA 诱导多能干细胞：为解决蛋白质直接导人细胞效率低下的问题，有研 究人员提出，mRNA、miRNA 及 siRNA 具有不会插入哺乳动物基因组的特点，在诱导 iPS 细胞中有着独特的优势。Derrick 等将 4 个关键蛋白质的 mRNA 导入人皮肤细胞，得到核糖 核酸诱导多能干细胞，同时使细胞重新编程的速度提高了一倍，而效率是标准方法的 100 倍以上。且因它们没有被改变基因组结构，因而比传统方法获得的 iPS 细胞更像 ES 细胞。 新近 Morryisey 等用 miR302/367 诱导小鼠和人体细胞生成了能分化成大部分组织的 iPS 细 胞，并将重编程效率提高了 100 倍，其机制可能与其能激活 Oct4 并抑制 HDAC2（组蛋白脱 乙酰基酶）的活性有关。     2．寻找安全的转运载体  导人的外源因子包含肿瘤相关基因并不是威胁 iPS 细胞安全 性的唯一因素，协助转录因子转染所用的病毒载体也有诱发肿瘤的风险。为此，寻找更为安 全的载体成为 iPS 细胞研究的另一热点。为此，Mostoslavsky等首次完成了仅用 1 个病毒载 体同时表达 4 种转录因子的实验，减少了细胞中病毒整合的位点，也降低了插入突变的概率。 也有人尝试使用更为安全的质粒作为载体。     还有研究比较不同来源的 iPS 小鼠后代的成瘤趋势和死亡率，发现从肝脏细胞和胃表皮 细胞诱导得到的 iPS 细胞形成的小鼠的成瘤趋势比由 MEF 细胞衍生得到的 iPS 小鼠要低很 多，且前者的死亡率更低，死亡时间较迟。这说明用于 iPS 细胞的供体细胞对于肿瘤形成有 不同敏感性。     3．iPS 细胞的应用研究  随着 iPS 细胞 相关研究的发展，人们更关注的是其临床应用 的潜能、安全性和可靠性。iPS 细胞不仅可用于细胞移植，器官再生，特别是细胞损伤、坏 死严重的疾病的细胞移植治疗；还可以构建疾病模型，以便于研究疾病形成的机制、发生发展及转归，筛选新的药物，以及研究新的治疗方法。     Jaenisch 等将小鼠成纤维细胞诱导为 iPS 细胞，并使其定向分化为造血前体细胞，细胞 移植发现 iPS 细胞来源的造血前体细胞能够成功治疗镰状红细胞贫血。此外，Xu 等人将 iPS 细胞分化为能分泌凝血因子Ⅷ的内皮祖细胞和成熟的内皮细胞，将其移植到血友病 A （hemophilia A）的小鼠肝脏中，有效地改善了病鼠出血症状。尽管这些实验是在小鼠中完 成的，但是验证了 iPS 细胞在结合基因治疗和细胞替代治疗中的可行性，为将来在人体上进 行类似治疗提供了实验依据。除了在治疗血液疾病中的应用外，iPS 细胞在神经系统疾病和 心血管疾病的治疗中也有广泛的应用前景。     4．iPS 细胞技术存在的问题  虽然 iPS 细胞与 ES 细胞非常相似，但二者仍然存在显著 的表观遗传学差距，这足以使人们担忧 iPS 细胞用于临床的安全性。研究发现，人类 iPS 细 胞仍携带有供体细胞的某些功能，张素春等比较了 5 个 ES 细胞系和用不同方法培育的 12 个 iPS 细胞系的分化能力，发现 iPS 细胞不能忠实地重现 ES 细胞所有分化能力。相比 ES 细胞，iPS 细胞分化发育成全身各类细胞的能力较低，可预测性较差。一系列的报道显示 iPS 细胞无论在点突变、拷贝数变异、还是 DNA 甲基化方面的变异都可能造成这些 iPS 细胞在 自然选择中被淘汰，目前无法真正地用于临床研究。     其次，iPS 细胞同样具有伦理问题，若将 iPS 细胞诱导分化为人类生殖细胞，将会有人 造婴儿的可能，这无疑使人们对 iPS 细胞的研究又一次提出了质疑。还有报道称，将小鼠 iPS 细胞分化成多种组织细胞后移植至该鼠体内时产生了快速免疫排斥，这一结果激发了人们对 于 iPS 细胞可行性的又一次深入的讨论。     此外，iPS 细胞的研究还存在以下问题：①转录因子将体细胞重编程为 iPS 细胞的机制， 以及 iPS 细胞的自我复制、定向分化调控机制尚未明了。②重编程效率太低。③诱导因子的 最佳组合尚待研究，外源载体和基因的插入存在潜在的致瘤性