底物: dNTP (dATP、dGTP 、dCTP 、dTTP)
聚合酶: 依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-pol)
模板: 解开成单链的DNA母链
引物: 提供3'-OH末端的寡核苷酸
其他酶和蛋白质因子: 拓扑异构酶、解螺旋酶、单链DNA结合蛋白、引物酶、连接酶
一、DNA hellicase (DNA解链酶)
也叫DNA解螺 旋酶，其通过水解ATP获得能量来解开双链DNA，每解开一对碱基，需水解2分子ATP→ADP+Pi(磷酸盐)
先与单链DNA结合。并沿DNA移动，使双链解开。
其分解ATP的活动 依赖于（需要） 单链DNA的存在
若双链有单链末端 或缺口（gap）：DNA helicase先结合于单链部分，然后向双链方向移动。
二、SSB蛋白（single-strand binding protein）
以四聚体形式存在于复制叉处，待单链复制后才掉下来，重新循环。
SSB蛋白（single-strand binding protein）
功能：稳定解开的DNA单链
①阻止其复性（防止单链重新结合成双链）
②保护单链部分不被核酸酶降解
三、Topoisomerase（拓扑异构酶）
1.拓扑异构体（topoisomerase）：除连接数不同，其他性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体。
拓扑异构酶：细胞内一类催化DNA拓扑异构体（topoisomerase）相互转化的酶，其为topoisomerase，其与DNA双条链形成共价结合的Pr-DNA中间体，在DNA双链骨架的3’，5’-磷酸二酯键处造成暂时的切口，使DNA的多聚核苷酸链得以穿越，通过改变DNA的连接数，而改变的分子拓扑结构。
2.topoisomerase分为二类：Ⅰ型、Ⅱ型
Ⅰ型拓扑异构酶：（E.coli拓扑异构酶Ⅰ，E.coli拓扑异构酶Ⅲ）
使DNA一条单链发生断裂再连接，（无须供应能量）每作用依次DNA连接数（L）改变1/次。
Ⅱ型拓扑异构酶：(拓扑异构酶Ⅱ<细菌的DNA旋转酶>，
拓扑异构酶Ⅳ：)
使DNA两条链同时发生断裂和再连接（引入超螺旋时需由ATP供能）; 每作用一次使DNA连接数（L）改变2/次.
四、复制的化学反应
聚合反应的特点
DNA 新链生成需引物和模板；
新链的延长只可沿5¢ → 3¢方向进行。
五、DNA聚合酶
全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)
简称：DNA-pol
活性：
1. 5¢®3¢的聚合活性
2. 核酸外切酶活性
1959 年获诺贝尔生理学或医学奖
Discovered an enzyme in E. coli that could catalyse the synthesis of DNA
• He called it DNA Polymerase
• Now known as DNA polymerase I
1959 - Nobel prize in Physiology or Medicine
1.聚合反应机理
2.聚合反应的特点
• 以单链DNA为模板
•聚合时必须有模板链和具有3’-OH末端的引物链。
•都需要Mg2+激活。
• 以dNTP为原料
• 引物提供3'-OH
• 聚合方向为5'→3'
• 遵守碱基互补规律
DNA聚合酶只能延长已存在的DNA链，而不能从头合成DNA链，那么，新DNA的复制是怎样开始的呢？
3.核酸外切酶活性
（一）原核生物的DNA聚合酶
• DNA-pol Ⅰ
• DNA-pol Ⅱ
• DNA-pol Ⅲ
• DNA-pol Ⅳ
• DNA-pol Ⅴ
1.DNA-polⅠ
功能：校读，去除RNA引物，填补空隙，参与DNA损伤修复。
2.DNA-pol II
• 具有5′→3′的聚合酶活性。
• 只是在无polⅠ及polⅢ的情况下暂时起作用。
• 对模板的特异性不高, 参与DNA损伤的应急状态修复。
3.DNA-pol III
★ 是复制延长中真正起催化作用的酶。
★ 由10种亚基组成不对称的聚合体。
★ α，ε，θ亚基组成核心酶，α亚基具有5‘→3’的聚合活性，ε亚基具有3‘→5’外切酶活性,θ亚基可能起组装作用。
★ β亚基(DNA夹子)能夹稳模板链，负责酶沿DNA模板滑动的作用。
★ 其余亚基统称为γ-复合物, 是DNA夹子加载蛋白。
（二）真核生物的DNA聚合酶
（三）DNA复制的保真性至少要依赖三种机制
1. 遵守严格的碱基配对规律；
2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；
3. 复制出错时DNA-pol的即时校读功能。
（四）复制中的分子解链及DNA 分子拓扑学变化
DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。
三、DNA复制中的其它酶与蛋白质
1.引物酶(primase)
▲ 依赖DNA的RNA聚合酶。
▲ 对利福平不敏感。
▲ 可以催化游离NTP聚合。
▲ 在大肠杆菌，是dna G 基因的表达产物。
▲ 催化RNA引物的生成。
引物（primer）：是由引物酶催化生成的短链RNA，它可为DNA聚合提供3'-OH末端。
2.DNA连接酶
连接DNA链3’-OH末端和相邻DNA链5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。
DNA连接酶的功能
◇ 在复制中起接合双链中单链缺口的作用。
◇ 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。
◇ 是基因工程的重要工具酶之一。
3.DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase)
拓扑是指物体或图像作弹性位移而又保持不变的性质。
解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象。
拓扑异构酶作用特点
既能水解 、又能连接磷酸二酯键
克服解链过程中的打结、缠绕现象
分 类
拓扑异构酶Ⅰ
拓扑异构酶Ⅱ
作用机制
拓扑异构酶Ⅱ的作用
4.解螺旋酶(helicase)又称解链酶或rep蛋白
利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。每解开一对碱基，需消耗2分子ATP。
5.单链DNA结合蛋白 (single stranded DNA binding protein, SSB)
在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整性。
