小鼠体外受精和胚胎培养

实验试剂

1.   IVF培养液

2.   HTF培养液

3.   SPS（无）

4.   石蜡油（无）

5.   PMSG

6.   HCG

7.   BSA

8.   1xPBS

9.   透明质酸酶（无）

10.胚胎培养液（细胞培养液）

实验仪器

1.   细胞培养箱

2.   培养皿

3.   注射器

4.   宽径枪头

5.   眼科剪

6.   解剖镜

7.   镊子

8.   倒置显微镜

9.   移液枪

操作步骤

1.   培养液准备

    每个管中加入1mL HTF培养液或IVF培养液，放入37℃细胞培养箱中，使用前加入50μL SPS。

2.   受精皿准备

A.   用平衡好的IVF培养液做一个200-300μL的精子获能滴，石蜡油覆盖，皿底外面标记小鼠编号及时间，放入37℃细胞培养箱中备用。

B.   用平衡好的HTF培养液做50μL/滴的卵子受精滴，每个皿中做4滴，石蜡油覆盖，皿底做好标记，放入37℃细胞培养箱中备用。

3.   精子的获能

    用HCG注射雌鼠14-15h后，用断颈法处死雄鼠，取出附睾及输精管放入含5%SPS的IVF培养液中，在两侧附睾尾用眼科剪剪出一个小的横切口，用镊子轻轻挤出精子，用灭菌的宽径枪头小心吸取，放入精子获能滴中。在培养箱中孵育10min，倒置显微镜下观察，精子扩散后，放入培养箱中继续孵育50min。

4.   MII期卵子的获取

    用10IU PMSG腹腔注射6-8周龄雌鼠，48h后再用10IU HCG腹腔注射，接着15-16h后断颈法处死雌鼠，剖开腹腔，将输卵管取出放入滴有150μL/滴HTF培养液的皿中。将有输卵管的皿放在解剖镜下观察，用两个1mL注射器针头配合切开输卵管壶腹部，释放COC（卵丘-卵母细胞复合体），用灭菌的宽径枪头将COC吸入准备好的卵子受精滴中或一个新的HTF培养液滴中，每200μL滴加2μL透明质酸酶，用枪轻轻吹打，当颗粒细胞消化一半的时候开始移卵，用HTF培养液洗卵3遍后，将卵移入事先准备好的卵子受精滴中。

5.   体外受精

用灭菌的宽径枪头吸取5-15μL精子至卵子受精滴中，放入培养箱中受精。精子密度1-5×10^6为宜（以放入培养箱中10min后能看到COC被精子打散，精子能推动COC运动或精子能推动卵子运动即可）。受精2h后，将受精卵吸出，置于新的HTF培养液中，继续培养4h，观察原核形成情况，继续培养，第二天观察是否分裂成二细胞胚胎。

6.   体外胚胎培养

A.   微滴培养：在培养皿上用移液枪做3滴50μL微滴，加入2ml处理过的石蜡油，放入37℃培养箱平衡1h，然后取出，分别将10枚2细胞小鼠胚胎加入1个微滴中，在放入37℃培养箱中培养，每48小时换液，分别在培养12、24、48、72h观察，记录。

开放式培养：取一干净的培养皿，在其中加入2-3ml培养液，在培养箱中平衡1h后加入2细胞胚胎，分别在培养12、24、48、72h观察，记录。