转基因动物的制备

动物基因工程的概念：指应用现代化的生物科学和遗传学技术，对动物基因进行操纵或改造的科学工程或指利用基因工程技术人为地改造动物的遗传特性的技术体系。

动物基因工程的实质是改变动物的遗传组成，增加动物的遗传多样性，赋予转基因动物新的表型特征，使能够更好地服务于人类社会。

高等动物基因工程包括两个方面，即高等动物转基因技术和高等动物基因表达技术。前者最终获得转基因动物，实现动物遗传性状的改良，后者即动物细胞工程，可用于蛋白多肽物质的大规模生产。后者操作过程即常规的基因工程操作。（见1-8章）。本章主要介绍转基因动物。

转基因的概念：将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，称之为转基因技术。

转基因动物：

所谓转基因动物就是指以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。

 一、转基因动物的技术路线

1、经典的技术路线：

将已经交配的供体动物的受精卵取出来，利用显微注射法注入含目的基因的重组载体，然后移植到受体动物的输卵管内让其妊娠，生产出的动物即转基因动物。

该方法的缺点是注入目的基因的命中率低，目的基因的            整合率低，受精卵移植的受孕率低。

2、整合胚胎移植的技术路线（P₂₈₆）：

选择优良精子和卵子在体外受精，将重组子导入受精卵中，体外培养获得多细胞胚胎或囊胚，检测整合有外源基因的胚胎，移植到受体动物的子宫中，获得转基因动物。优点是受精卵的成活率高达90％以上，外源基因整合率高，提高受孕率。

3、核移植（克隆）的技术路线

将目的基因导入体细胞中，取其细胞核，同时将动物卵细胞去掉细胞核，两者融合为重组的受精卵，体外培养成囊胚期胚胎，移植到受体动物的子宫中，妊娠后获得转基因动物。

特点是体细胞核移植；核移植前导入目的基因。

4、整合卵受精的技术路线：

目的基因借助反转录病毒感染卵母细胞，发育成成熟的卵细胞后于精子体外受精，受精卵培养成囊胚后移植到受体动物的子宫中，妊娠后获得转基因动物。

二、目的基因的制备方法

1、目的基因的获得：逆转录合成法、化学合成法 、PCR扩增法、基因文库法（同前几章）

2、目的基因的扩增：可以通过载体在宿主中克隆，也可以通过PCR扩增目的基因。

三、动物基因工程的载体

1、质粒型表达载体

表达载体的共同特点是都带有原核复制区和选择性标记基因，保证重组DNA分子能够在大肠杆菌中扩增。同时也必须包括能在真核细胞表达的相关组件，如启动子、转录产物有效地加上poly（A）尾巴所必需的信号序列、真核细胞中的选择性标记、增强子等以保证外源基因的高效表达。

2、病毒载体：作为基因转移的病毒载体须具备以下基本条件：

（1）携带外源基因并能够包装成病毒颗粒；

（2）介导外源基因的转移与表达；

（3）对机体不致病，即安全。

常用的动物病毒载体，如SV40病毒载体、杆状病毒载体、反转录病毒载体、腺病毒载体、乳头状瘤病毒载体等。

四、基因导入的方法

1、磷酸钙法  

将待转染的DNA溶解在磷酸缓冲液中，加入CaCl2后，DNA片段与磷酸钙共沉淀并形成大的颗粒；将此颗粒悬浮液加入贴壁培养的细胞中，外源DNA就被靶细胞所吸收，进而实现转基因。类似于教材的DEAE-葡聚糖转染法，另外还有脂质体转染法等（祥见第六章）。

2、显微注射法 

显微注射法是在显微注射仪上，一侧用吸管固定受精卵，另一侧将注射针插入受精卵原核。拔出显微注射针解除固定管的负压，操作完成。再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。 

显微注射法是最早使用、至今仍在使用的较成熟的基因导入方法。其缺点是：整合效率低（小于1%）；不能定点整合，影响基因表达和遗传稳定性；方法复杂、设备昂贵。

如转基因小鼠的制备：通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配，然后杀死雌鼠，从其输卵管内取出受精卵；用显微注射仪将重组分子注入受精卵中，再移植到代孕小鼠的输卵管中，生产出小鼠经Northern blotting鉴定即可。

3、病毒感染法

最早用来得到转基因小鼠的方法，利用逆转录载体将遗传信息以RNA分子的形式，在逆转录整合酶等的作用下，反转录并整合到宿主基因组中去，最终得到转基因小鼠。

以病毒DNA为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒颗粒共转染特定的受体细胞。这种方法具有定向性好、实验重复性佳、导入效率高等优点，但也存在一定的缺陷，如目前常用的载体宿主范围有限，往往无法转染一些具有重要经济价值的家禽和牲畜细胞等。

具体过程为：

（1）构建含有选择性标记的反转录病毒基因组部分DNA与质粒的杂合型载体分子；

 （2）在多克隆位点插入外源基因形成重组DNA分子，克隆到大肠杆菌中扩增鉴定；

（3）重组DNA分子通过物理或化学方法转入一个体外的病毒包装细胞系。

（4）转染入包装细胞系的重组DNA转录出相应的重组RNA分子，被包装为的重组反转录病毒，以其感染其他类型动物受体细胞，

（5）外源DNA整合到染色体上，并表达外源蛋白。

4．胚胎干细胞（ES细胞）法

胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团中分离出的未分化、具有正常二倍体染色体和发育全能性的细胞。

优点：可以在体外进行人工培养、长期扩增、冷冻保存

胚胎干细胞制备转基因动物过程：

（1）转基因胚胎干细胞的获得：将外源基因导入体外培养的ES细胞，经筛选后获得整合稳定和表现良好的细胞。

（2）囊胚注射：筛选出的含有外源基因的ES细胞经扩增之后注射到胚泡期的胚胎中，其中部分ES细胞可与胚泡期胚胎的内细胞团融合并参与其分化，形成嵌合体。

（3）移植：将注射后的胚胎移植入母体子宫内，生出的后代的部分生殖细胞就有可能是由转基因的ES形成的，然后再将后代进行杂交育种就能得到纯的转基因动物。

5、生殖细胞载体法

有体外和体内转染生殖细胞的两种方法，前者又包括精子载体法、卵子载体法、受精卵载体法、胞浆内精子注射法等。
    精子载体法是将成熟的精子与外源DNA的载体共同孵育，使精子携带外源DNA，受精后外源DNA整合至染色体中。
    此法理论上是可行的、也有成功的先例，但成功率不高、效果不稳定，有待继续探索、完善。

6、基因同源重组法：即基因打靶。其基本程序是：

（1）将外源打靶基因（即外源基因，要整合的基因）与特异性打靶位点同源的DNA片段等克隆到具有选择标记的载体上，构建专用的基因打靶载体；（打靶位点即整合位点）

（2）基因打靶载体用适当的内切酶消化后（变成线性的），转化受体细胞；

（3）在细胞内重组酶的作用下，打靶载体与基因组打靶位点的两条同源DNA的相应部位间发生单链断裂、链的交换、磷酸二酯键的形成和缺口重新封闭等一系列变化，并最终完成同源重组，实现外源基因在动物基因组中的定位整合。

五、转基因动物的鉴定

转基因动物的鉴定，可从三个水平上进行鉴定：

（1）DNA水平：Southern bloting、PCR、斑点杂交等

（2）RNA水平（即检测其转录本）：Nouthern bloting、RT－PCR等

（3）蛋白质水平：SDS-PAGE、 ELISA Western bloting等