外源基因的表达与检测及植物基因工程的应用

外源基因的表达与检测

（一）外源基因的表达与调控：

1．转基因沉默：外源基因整合进受体植物的基因组后，即使没有发生突变或丢失，其表达水平也很低，甚至不表达，这种现象称为转基因沉默。

其机理及相应措施主要有：

DNA甲基化——使外源基因甲基化后降低其转录水平。措施：采用去甲基化序列或试剂。

多拷贝整合——实践证明，外源基因多拷贝的整合会导致转录水平降低。措施：可采用农杆菌转化或选择完整的单拷贝序列

位置效应：导致基因沉默。措施：外源基因的随机整合建立位点特异重组体系

后成修饰作用

2、提高外源基因表达水平的策略

（1）启动子的选择与改造：选择强启动子。

（2）利用增强子序列：增强转录。

（3）利用真核基因的调控序列：利用这些顺式调控原件有利于提高表达水平。

（4）利用定位信号提高外源基因表达产物的含量：如信号肽序列将目的蛋白引入胞外，防止被蛋白酶降解。

（5）叶绿体转化：将外源基因插入叶绿体基因中进行转化，由于其拷贝数高，因此表达水平高。

（二）外源基因的检测——利用报告基因检测

报告基因：指其编码产物能够被快速测定、常用于判断外源基因是够成功地导入体细胞，是否启动表达的一类特殊用途的基因。

理想报告基因的基本要求：

1．受体细胞不存在相应的内源等位基因的活性（即受体细胞本身没有该基因，只有载体或重组子进入后才具有这种基因）。

2．它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞。

3．具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的检测特性。

目前最常用的报告基因有：ß -葡萄糖苷酸酶基因（gus）、氯霉素乙酰转移酶基因、荧光素酶基因等。

1．ß -葡萄糖苷酸酶基因（gus）

gus基因编码ß -葡萄糖苷酸酶，存在于某些细菌体内，该酶是一种水解酶，能催化许多ß -葡萄糖苷酸类物质的水解。绝大多数的植物细胞内不存在内源的GUS活性，许多细菌及真菌也缺乏内源GUS活性，因而gus基因被广泛应用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化实验中，gus基因应用最多。可将无色底物转变为蓝色产物，利用颜色反应即可检测。

2．氯霉素乙酰转移酶基因

该基因来自大肠杆菌转座子Tn9，它能够催化乙酰基团从乙酰辅酶A转移到氯霉素分子上，导致氯霉素分子发生乙酰化作用，从而使其失去活性。真核细胞中不含有氯霉素乙酰转移酶基因，无该酶的内源活性，因而该基因可作为真核细胞转化的选择基因及报告基因。

Cat基因转化的植物细胞能够产生对氯霉素的抗性，而非转基因植物则不具有这种抗性，cat基因的活性可以通过反应底物乙酰辅酶A的减少或反应产物乙酰化氯霉素及还原型辅酶A的生产来测定，常用的方法有硅胶G薄层层析法及分光光度法等。

3．荧光素酶基因

该基因有很多种，它可以催化荧光素发出荧光。荧光素是荧光素酶催化的底物总称，不同荧光素的化学结构有一定差异甚至完全不同。荧光素酶基因的活性检测非常简单，直接将被检的材料浸入加有荧光素和ATP的缓冲液中，置于暗室用肉眼直接观察荧光，或覆盖X-光胶片曝光，也也用荧光光度计定量检测。

植物基因工程的应用

（一）植物基因工程在植物分子生物学研究中的应用（了解） 

1．转座子标签：分离基因及判断突变基因的功能

2．T-DNA标签法：分离基因及判断突变基因的功能

3．反义RNA技术：部分抑制基因表达构建缺失突变、对靶RNA的存在及代谢活动进行标定

4．位点特异性重组系统：定位并克隆基因；研究基因及DNA序列的功能；研究植物的发育及生理；建立大片段物理图谱。

（二）改良植物品种

1．抗性基因工程

研究最早、技术最为成熟、应用规模最大的植物转基因技术。包括抗虫基因工程、抗病基因工程、抗除草剂基因工、抗逆基因工程。

（1）抗病虫害的转基因植物

昆虫对农作物的危害极大，全世界每年因此损失数千亿美元。目前对付昆虫的主要武器仍是化学杀虫剂，它不但严重污染环境，而且还诱使害虫产生相应的抗性。将抗虫基因导入农作物是植物基因工程的得意之笔，能避免化学杀虫剂所造成的许多负面影响。目前，抗虫作物已占全球转基因作物的22％。用于构建抗虫害转基因植物常见的外源基因有苏云金芽孢杆菌的毒晶蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、凝集素基因等40多个。 

（2）抗病毒感染的转基因植物

转基因甜椒、番茄等。

2．植物品质改良基因工程：提高植物的营养价值、产量等。

（1）蛋白质、碳水化合物和脂肪品质改良

改良途径：⑴将编码广泛氨基酸组成或高含硫氨基酸的种子储藏蛋白基因导入植物;

⑵将某些蛋白质亚基基因导入植物； 

⑶将与淀粉合成有关的基因导入植物；

⑷将与脂类合成有关的基因导入植物。

（2）果品的成熟品质改良

果品的货架存放期直接影响商业价值,人们可以通过这个技术来改变果品成熟后的品质。

（3）观赏园艺植物的品质改良：改变花色、香气、开花期等

（三）利用转基因植物生产功能蛋白

转基因植物作为生物反应器的优势：

植物易于生长，农田管理成本相对低廉，操作技术要求也不高；

植物具有完整的真核表达修饰系统，利用转基因植物生产的重组蛋白药物和疫苗在分子结构和生物活性上，与人体来源的蛋白质相似；（这一点优于原核细胞）

绝大多数植物的表达产物对人和牲畜无毒副作用，安全可靠；

1．转基因烟草表达小鼠抗体

借助于根瘤农杆菌介导的转化系统，将小鼠抗体的轻链和重链编码基因分别置于两种烟草植物体内表达，然后两种重组植物品系进行杂交，产生的子代植物能同时合成小鼠的轻链和重链两种多肽。从这种转基因烟草的叶子里可检测到完整的抗体分子，含量为叶细胞蛋白总量的1.5%。提取叶细胞总蛋白后进行分离即可。

2．转基因植物生产疫苗

3．转基因植物生产其他多肽与蛋白质类药物

4．利用转基因植物生产糖类、脂类物质

5．利用转基因植物生产可降解生物塑料