植物基因工程的载体系统及转化方法

植物基因工程的概念：

植物基因工程是以植物为受体的一种基因操作，即以分子生物学为理论基础，采用基因克隆、遗传转化（根癌农杆菌Ti质粒介导法、基因枪法、原生质体介导法等），以及细胞、组织培养技术将外源基因转移并整合到受体植物的基因组中，并使其在后代植株中得以正确表达和稳定遗传，从而使受体获得新性状的技术体系。

转基因植物的应用前景和理论意义：

（1）通过将目的基因导入农作物、园艺作物中，改变它们的遗传特性，使植物免受病虫的危害，或获得抗除草剂的特性，或改变种子中淀粉、蛋白质的含量和组成、或改变花的形状和颜色等。

（2）转基因植物可作为一种生物反应器，生产药用蛋白和植物次生代谢产物（糖类、脂类、核酸和蛋白质等是植物的初生代谢产物,植物体中还有许多其他有机物，如萜类、酚类和生物碱等，它们是由糖类等有机物次生代谢衍生出来的物质，因此称为次生代谢产物），或生产某些有机化合物。

（3）转基因植物为人们研究某一基因功能及其在生长发育中的作用提供了强有力的工具。

转基因作物发展现状

（1）国际：在1996年到2004年间，全球转基因植物的生产和利用超出了当初预料，基因作物种植面积增长了近48倍，从1996年的170万公顷增加到2004年的8100万公顷。在2004年全球转基因作物种植面积仍有66%在工业化国家，但发展中国家转基因作物的种植面积已逐年增加。

（2）国内：在某些领域达到了国际先进水平。2004年全国转基因作物种植面积为370万公顷，成为继美国、阿根廷、加拿大、巴西之后的转基因植物种植第五大国。

植物基因工程的载体系统——农杆菌及其转化体系

双子叶植物（尤其是豆科类植物）的根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌根癌农杆菌（A.tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒Ti（Tumor-inducing plasmid）介导的。

Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合环状DNA分子，约有200kb。 

1．Ti 质粒的结构与功能

（1）Vir区：该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。

（2）T-DNA区：T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，故称之为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。

（3）Con区：即结合转移区。该区段上存在着与细菌间接合转移相关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。

（4）Ori区：该区段基因调控Ti质粒的自我复制起始。

Ti 质粒致瘤的分子机制：损伤的植物根部会分泌出乙酰丁香酸和羟基乙酰丁香酸，它们能诱导Ti质粒上的vir基因以及根瘤菌染色体上的一个操纵子表达。vir基因产物将Ti质粒上的T-DNA单链切下，而根瘤菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA结合形成复合物，后者转化植物根部细胞。

2．Ti质粒的改造策略

Ti质粒是植物基因工程的一种天然载体，但野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体存在着学多障碍：

（1）质粒过大，操作困难

（2）大型的Ti质粒有多个酶切位点

（3）对内源性植物激素的影响：Ti质粒的onc基因（致瘤基因，包括生长素基因和细胞分裂素基因）产物会干扰植物内源性激素的平衡，导致冠瘿瘤的产生，阻止了植株的再生（即不能获得具有新性状的植物）。

（4）没有E.col的复制起始点和植物细胞的筛选标记基因

Ti 质粒的改造

①除去T-DNA上的生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因，因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物； 

②除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长；

③除去 Ti 质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度；

④安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作；

⑤安装植物细胞的筛选标记，如 neo^r 基因（新霉素抗性基因），使用植物基因的启动子和polyA化信号序列；

⑥安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆（利用末端脱氧核苷酸转移酶加多聚物尾巴）。

3．共整合载体

（1）首先构建中间载体，如将大肠杆菌pBR322质粒带上一段与Ti质粒T区同源的一个片段，同时带有植物选择性标记基因和农杆菌的复制起始区，它在大肠杆菌和农杆菌中均能复制；

（2）将目的基因插入该片段的适当位置，使目的基因两端带上与Ti质粒T-DNA同源的DNA序列；

（3）然后将该质粒通过转化或接合引入含有Ti质粒的农杆菌中。

（4）引入的衍生质粒（含有目的基因的中间质粒）和原细胞中Ti质粒具同源性，因而可产生无性配对重组，通过交换，可将目的基因转到Ti质粒上，使之产生真正的具有外源基因的Ti质粒，称共整合质粒。

共整合转化程序：PPT图中的NPT-Ⅱ是植物细胞的筛选标记基因。先将目的基因插入中间载体的多克隆位点中，成为重组质粒，转化入大肠杆菌中。然后将含有卸甲Ti质粒载体的农杆菌和上述大肠杆菌共同培养，通过细菌间的结合转移，使重组质粒进入农杆菌中，与卸甲Ti质粒重组。重组质粒可进一步整合到植物的染色体上，改变其性状。

4．双元载体

（1）双元载体，也称反式载体，是指由两个分别含T-DNA和Vir的相容性Ti质粒（能够在同一宿主细胞中共存，含有不同来源的复制起始区）构成的双质粒系统。

（2）其中之一是含有T-DNA转移所必需的Vir区的质粒，但本身的T-DNA区段已缺失或突变（称为辅助质粒）；另一个则是含有T-DNA区段的寄主范围广泛的DNA转移载体质粒，后一种质粒较小，可在大肠杆菌中复制，因而易操作，可用来插入外源基因（插入T-DNA区域内，可以转移），称为微型质粒。

（3）两种质粒同时存在时可恢复T-DNA的转移功能。

二元整合转化程序：

①将外源基因克隆在大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒的T-DNA区内；

②重组质粒直接转化农杆菌株，该菌株携带只含vir区不含T-DNA区的Ti辅助质粒；

③以上述重组农杆菌感染植物细胞，目的基因随着T-DNA区域转到宿主细胞的基因组上。

除了这两种载体系统外还有隔端载体系统，见P₂₅₅，自学。

植物基因的转化方法

（一）植物基因转化受体系统

成功的基因转化首先依赖于良好的植物受体系统的建立。

受体系统：用于转化的外植体（受体植物）通过组织培养途径或其它非组织培养途径（如发苗产生子叶、胚轴等），能高效、稳定地再生无性系（能再生植株），并能接受外源DNA整合，对转化选择抗生素（如新霉素）敏感的再生系统。

1．植物基因转化受体系统的条件

（1）具有稳定的外植体来源：无菌实生苗（实生苗是由种子繁殖得到的苗株，有别于无性繁殖得到的嫁接苗等。实生苗具有生长旺盛、根系发达、寿命较长等特点）、快繁试管苗

（2）高效稳定的再生能力：常选用营养生长中心（分生组织）、薄壁细胞

（3）较高的遗传稳定性

（4）对选择性抗生素敏感

（5）对农杆菌侵染有敏感性

（6）具有经济价值或具有潜在的生产应用价值和理论研究意义。

2．植物基因转化受体系统的类型

（1）愈伤组织再生系统：转化率高，适用性广，但变异大；

（2）直接分化再生系统：操作简单，稳定性好，但转化频率较低；

（3）原生质体再生系统：高效摄取外源DNA，但易变异，再生频率低；

（4）胚状体再生系统：是最为理想的基因转化受体系统；

（5）生殖细胞受体系统（种质系统）：高效摄取外源DNA，基因充分表达，与育种结合紧密，但受季节限制（只在一定的季节才产生生殖细胞）。

（二）植物基因的转化方法即基因的导入方法

1．农杆菌转化程序

工程农杆菌的制备：

（1）平板杂交（即P₂₅₈的三亲交配法）：供体菌及受体菌混合培养在琼脂板上实现Ti质粒的接合转移。

（2）直接转化法：用含有目的基因的中间载体质粒DNA直接转化农杆菌。（此法用得较多，但效率较低）

农杆菌对植物的转化（即含有重组子的工程农杆菌转化入植物中）：

（1）农杆菌的培养、纯化、保存。

（2）Vir区基因活化诱导物的使用（如使用一些糖类物质或者酚类物质活化毒性基因，从而介导含目的基因的T-DNA的整合）。

（3）转化：包括整体植株接种共感染法，叶盘转化法，原生质体共培养转化法等。

2．基因枪：

将待转化的DNA沉淀在细小金属珠的表面，用特制枪将金属珠直接打入植物细胞。然后通过细胞和组织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。

该法主要优点是不受受体植物范围的限制。而且其载体质粒的构建相对简单。

植物细胞通常是胚胎细胞、玉米籽、叶子等，但进去的DNA片段整合效率极低。

3．花粉管导入法

将外源DNA沿着花粉管经过珠心进入尚未形成正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中，从而实现基因的转移。

该方法于80年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。

该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。

4．融合法

将外源DNA与特殊的疏水性高分子化合物（如磷酸钙）混合，在水中这些疏水性化合物分子形成球状的脂质体，后者与植物细胞原生质体融合，筛选融合子，再生植物细胞壁。 

所有涉及到植物原生质体的基因转化方法均存在一个难题，即：原生质体很难再生出整株植物（即很难建立原生质体再生系统，所以转化频率较低）。 

5．电击法

将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原生质体悬浮液中，混合物在200-600V/cm 的电场中处理若干秒钟，然后将原生质体在组织培养基中生长1-2周，再生出整株植物（同样难建立原生质体再生系统，所以转化频率较低）。 

6．显微注射

利用显微注射仪将外源基因直接注入到已固定的植物细胞的细胞核或细胞质中（必须固定，否则很难注射进去），从而实现基因转移。受体细胞最初仅用原生质体，现在已发展成为适用于带壁的悬浮细胞、花粉粒、卵细胞、子房等。

显微注射法突出的优点是转化率高，整个操作过程对受体细胞无药物毒害，有利于转化细胞的生长发育。其缺点是操作繁琐耗时，工作效率低，并需精细的操作技术和精密的仪器设备。