微生物基因工程的应用

1973年，波依尔（Boyer）和科恩（Cohen）首次完成外源基因在大肠杆菌中的表达。几年后，第一个基因工程产品——利用构建的基因工程菌生产人胰岛素获得成功，从此人类进入了生物技术的产业时代。

一、重组微生物工程菌与人类药物生产

基因工程产品约有2/3用于人类疾病治疗和预防性用药，它给制药工业带来了革命性的变化。据估计，人用蛋白药物的全球市场，每年可达200亿美元，而且还在持续增长。在这种巨大利益驱使下，世界各大制药公司相继投入巨资用于这些重组蛋白药物的研究开发。

（一）重组人胰岛素生产

胰岛素是由人和动物的胰脏β-胰岛细胞合成的蛋白质，是治疗胰岛素依赖型糖尿病的药物。

1982年，美国Ely Lili公司使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，这是第一个上市的基因工程药物。

（二）重组人生长激素生产

人生长激素（hGH），又叫做促生长素，具有调节生长与发育的功能，对多种人类疾病诸如垂体性侏儒症、特纳氏综合症、组织坏死等，都具有良好的治疗效果。

hGH的来源是从死人的脑垂体中提取，这种制备方法不仅材料来源困难，无法大量生产，而且存在安全性问题（可能会感染尸体中的病毒）。

1985年，这种由 E.coli 生产的rhGH已成为得到美国政府许可生产和使用的第二种基因工程药物，目前已工业化生产。

（三）重组人干扰素生产

干扰素是最早发现的细胞因子，早在1957年英国医生发现流感病毒处理的细胞产生一种因子，可抵抗病毒感染，干扰病毒的复制，因而命名为干扰素 (interferon, IFN)。

（四）重组人抗体及其片段的生产

抗体是存在于血清中的免疫球蛋白，它是脊椎动物受到抗原刺激时，由其免疫系统产生的一类糖蛋白，在高等动物自身免疫系统中具有多种生理功能。

二、重组微生物工程菌与疫苗生产

自从200多年前人们发现，预先接种过牛痘的人能够抵御天花感染的现象，并据此提出免疫的概念后，疫苗就已被广泛地用来预防多种传染病的传播。

基因工程疫苗是指用重组DNA技术克隆并表达保护性抗原基因，利用表达的产物或重组体本身制成疫苗。

1、基因缺失活疫苗

用基因工程方法对细菌和病毒进行改造，以去除与毒力有关基因获得的缺失突变株制成疫苗，这种疫苗称为基因缺失活疫苗。由于基因缺失疫苗含有活的病原体，因此其免疫过程与弱毒疫苗一样，类似于自然感染，因此可诱导全面免疫应答。而且免疫持续期长，免疫原性好。即该疫苗具有弱毒疫苗所有的优点，而且比弱毒疫苗更加安全。目前已有多种基因缺失疫苗问世，例如伪狂犬病毒基因缺失疫苗，该苗是将伪狂犬病病毒TK基因缺失使其毒力致弱而获得的，是1986年1月得到美国FDA（美国食品药品管理局）批准从实验室到市场的第一个基因缺失疫苗。在注册之前即已证明该疫苗无论是在环境中还是对动物都比野生型病毒和常规疫苗弱毒更安全。

2、基因工程亚单位疫苗

对于致病性病毒而言，单纯的外壳结合蛋白即可在受体体内激发生成足够多的抗体。

通过重组DNA技术构建的只含有一种或几种抗原，而不含有病原体的其他遗传信息的工程菌生产的疫苗，称为基因工程亚单位疫苗，如目前应用的乙肝疫苗等。

3、核酸疫苗

又称基因疫苗，是指使用能够表达抗原的基因本身（即核酸）制成的疫苗。

其显著特点是疫苗制剂的主要成分不是基因表达产物或重组微生物，而是基因本身（即核酸）。还没有产品问世，DNA疫苗的安全性问题。还有RNA疫苗。

4、蛋白工程疫苗

蛋白工程疫苗是指将抗原基因加以改造，使之发生点突变、插入、缺失、构型改变，甚至进行不同基因或部分结构域的人工组合，以期达到增强其产物免疫性，扩大反应谱，去除有害作用或副反应的一类疫苗。

三、重组微生物工程菌与食品、饲料工业

（一）重组工程菌与干酪生产

传统的利用乳酸链球菌和黏酪链球菌生产干酪的过程中存在问题：

①在发酵中，使用的原本具有良好性能的引子培养物（即种子培养物），会突然变质生产出不合格的劣质产品。

②引子培养物易遭受噬菌体感染，给干酪生产造成严重的经济损失。

③干酪工业生产中排放的废物对环境的污染问题。

可应用重组DNA技术，把参与乳制品发酵作用的质粒基因（如控制发酵的蛋白酶基因、抗噬菌体感染的基因等）整合到乳酸链球菌的染色体基因组上，便能够培育出高稳定性的供作引子培养物的工程菌株。

（二）重组工程菌与单细胞蛋白质生产

微生物蛋白产品又称为单细胞蛋白，是指干燥的微生物细胞，包括藻类、细菌和酵母等，或是指纯细胞培养物的总蛋白提取物。可用作饲料添加剂和食品添加剂，应用较广，但也有一些缺点，如成本高等。

改造的目的：

（1）使目标细菌获得超量表达某种特定蛋白的能力：将目的基因克隆到强启动子下游，构建质粒，导入宿主菌中表达。

（2）改善单细胞蛋白的营养质量：主要是对目的基因进行改造，增加人体必须的一些氨基酸。

（三）重组工程菌与酿酒工业

酿酒酵母是酿酒工业中使用的一种重要的发酵微生物，现在已能用DNA重组技术，培育出新的酿酒酵母菌株，用于改进传统的酿酒工艺，并使之更加多样化。

（四）重组工程菌与氨基酸生产

氨基酸的大规模工业化生产主要有：蛋白质降解法和微生物发酵法两种方法，后者所用菌种一般为棒状杆菌，要提高产量就要获得高产菌株。

高产菌株的获得方法：

（1）利用传统诱变技术改良棒状细菌的野生株。

（2）利用重组DNA技术构建高产的工程菌（将氨基酸合成关键酶基因导入宿主菌中）。

（五）重组工程菌与维生素生产

维生素是维持细胞生长和正常代谢所必需的微量有机化合物，其作用大都是作为辅酶分子的结构成分参与生物体内的代谢反应，也有少数维生素具有一些特殊的生理机能。以前的生产方法主要是通过化学处理或者提取的方法获得维生素，生产工艺较复杂，现在已能用重组工程菌生产维生素C。

四、重组微生物工程菌与环境保护

随着工农业生产的发展、人口的增长，人类活动对环境的污染不断增长，尤其是现代大工业的出现，极大地改变人类物质生活条件的同时也带来了环境问题。

微生物作为一个整体分解有机物的能力是惊人的，但绝大多数降解污染物的微生物都来自土壤的假单胞菌，而不同菌株分解污染物的能力及所需条件又存在很大差异。因此，从整体考虑。环境保护工程菌的开发应包括从降解污染物菌株的筛选、目的基因分离到工程实施与技术鉴定的全过程，而基因工程菌的构建是其中的中心环节。

构建原理：采用现代分子生物学和分子生态学的原理和方法，充分利用环境微生物的生物净化﹑生物转化和生物催化等特性的功能基因，构建高效表达的基因工程菌进行污染治理﹑清洁生产和可再生资源利用，多层面和全方位地解决工业生产和生活废弃物污染﹑石油和煤炭脱硫﹑农药残留﹑能源和材料短缺等问题。 如向假单胞菌中导入降解质粒或者降解基因。

优点：与化学﹑物理等其他技术相比，环境微生物基因工程技术具有效率高﹑成本低﹑反映条件温和以及无二次污染等显著优点，同时还可以增强自然环境的自我净化能力。 

应用范围：工业和生活废水治理﹑重金属污染土壤的生物修复（bioremendiation）﹑农药残留的微生物降解﹑生物制浆和生物漂白等清洁生产技术的建立﹑石油污染的消除以及可再生材料的合成等诸多方面。

    美国科学家培育出的“超级工程菌”（superbug）。

五、重组微生物工程菌与农业生产

基因工程在农业微生物中的应用主要包括重组根瘤菌、重组联合固氮菌、微生物农药、动物和植物生长激素、饲料用酶制剂等。

例：重组苏云金杆菌杀虫剂

苏云金芽孢杆菌的营养体生长到一定阶段时，在菌体的一端形成芽孢，另一端形成近菱形的蛋白质结晶。此晶体称为伴胞晶体，它由一种或多种蛋白组成（是δ毒素，ICP），具有高度特异性杀虫活性，对哺乳类动物无害。传统的苏云金杆菌杀虫剂存在杀虫谱窄，作用时间短等缺点，可通过基因工程方法进行改造。

构建重组菌株进一步提高ICP杀虫剂产业化水平的目标有：

（1）提高ICP产量：使用强启动子。

（2）扩大杀虫谱：将多个杀虫基因转入同一株菌株中。

（3）提高毒力：改变毒素基因的氨基酸序列，增强毒性。

（4）延长持续期并改善释放性能：选择适宜的表达系统。

随着基础生物科学和分子遗传学研究的突飞猛进，特别是随着人类对包括细菌在内的各种生物的基因组研究的深入，为揭示各类生物基因结构与功能提供了大规模﹑高通量和自动化的研究手段和全新思路，细菌基因工程研究的范围也进一步拓宽。 

在积极促进细菌重组技术发展的同时也要高度重视和预防转基因细菌对健康和环境可能存在的风险。为此，要严格按照转基因生物安全管理条例的要求，认真开展重组细菌的生物安全性评价研究。