酵母菌基因工程

酵母菌作为真核生物表达系统的优点（见第八章）

一、酵母菌宿主系统

（一）酿酒酵母

特点：

（1）有几个很强的基因启动子

（2）其质粒可作为内源表达载体：含有2mm质粒（见第八章）。

（3）可以对蛋白进行多种翻译后修饰。

（4）自身分泌蛋白少，重组蛋白纯化方便

（5）具有较高的安全性

应用：乙型肝炎疫苗、人胰岛素和人粒细胞集落刺激因子的表达与生产

（二）巴斯德毕赤氏酵母

优点：

（1）具有强有力的乙醇氧化酶基因启动子，可严格控制外源蛋白的表达

（2） 可对表达的蛋白进行翻译后的加工和修饰

（3）营养要求低，培养基廉价，便于工业化生产

（4）可高密度发酵培养

（5）表达量高

（6）表达的蛋白既可存在于细胞，又可分泌到胞外

（7）糖基化程度低：不象酿酒酵母那样高。

二、酵母的载体系统

酵母菌载体的分类：

酵母菌载体可根据其在酵母细胞中的复制形式、载体用途、载体表达外源基因的方式等分类。按复制形式可分为质粒载体、酵母整合载体（YIp）、酵母人工染色体（YAC）。质粒载体又可分为酵母附加型质粒（YEp）、酵母复制型质粒（YRp）、酵母着丝粒质粒（YCp）。祥见第八章。

三、酵母菌的转化系统

（一）酵母菌的转化程序

1、酵母菌原生质体转化法

早期酵母菌的转化都采用在等 渗缓冲液中稳定的原生质体转化法，在 Ca²⁺ 和 PEG 的存在下，转化细胞可达原生质体总数的 1-2%。但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25-33%

2、碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化

酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如 Li+等）、PEG、热休克处理后，也可高效吸收质粒 DNA ，而且具有下列特性： 

吸收线型 DNA 的能力明显大于环状 DNA，两者相差 80 倍

共转化现象极为罕见

3、酵母菌电击转化法：酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA，但在此过程中应避免使用 PEG，它对受电击的细胞具有较很大的负作用。电击转化的优点是不依赖于 受体细胞的遗传特征及培养条件适用范围广，而且转化率可高达10⁵/µgDNA 。

（二）用于酵母菌转化子筛选的标记基因

1、营养缺陷型互补基因

主要有营养缺陷型互补基因和显性基因两大类营养缺陷型互补基因主要有氨 基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA、 ADE，但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难。

2、显性标记基因

显性标记基因的编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白。

aph    氨基糖苷转移酶     抗G418

cat    氯霉素乙酰转移酶    抗氯霉素

dhfr   二氢叶酸还原酶      抗氨甲喋呤和磺胺

cup1   铜离子螯合物       耐受铜离子

suc2   蔗糖转化酶         耐受高浓度蔗糖

ilv2   乙酰乳糖合成酶      抗硫酰脲除草剂

四、酵母菌的表达系统

1、温度控制型表达系统：

如酿酒酵母PHO5 启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开。PHO4基因编码产物是PHO5 启动子的正调控因子，PHO4温度敏感型突变基因pho4^TS的编码产物在35 ℃时失活，因此启动子不能打开，所以装在pho4^TS-PHO5 启动子下游的外源基因在35 ℃时关闭，而在23 ℃时pho4^TS的编码产物有活性，可诱导目的基因的表达。

2、超诱导型启动子