细菌基因工程

细菌与基因工程关系密切：

1、细菌是单细胞﹑结构简单的原核微生物，目前对其生理代谢途径以及基因表达的调控机制研究较为透彻；

2、细菌的物种和代谢类型多种多样，对环境因子敏感，易于获得各类突变株；

3、生长速度快，便于大规模培养，容易进行遗传操作。 

因此基因工程操作中，人们经常将细菌作为克隆外源基因的宿主细胞，无论目的基因是原核基因还是真核基因都可以在其中获得克隆。

一、实现外源基因表达的基本操作

原核细胞表达原核基因以及真核细胞表达真核基因较为容易，然而原核细胞表达真核基因则存在一定的困难：

①原核细胞RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子。

②由于真核基因为不连续基因，因而必须将内含子切除后才能成为成熟的mRNA，但原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。

③在原核细胞中，mRNA必须含有SD序列才能和核糖核蛋白体结合，从而指导蛋白质的合成。而真核基因转录的mRNA缺少SD序列。

④真核基因在原核细胞表达产生的外源蛋白很不稳定，容易被原核细胞蛋白酶所破坏。

解决办法：

1、将真核基因克隆到原核启动子和S-D下游。这样，RNA聚合酶即可识别该启动子，核糖体也可以结合在S-D序列上启动翻译。

2、所要表达的真核基因选用mRNA反转录后的cDNA。cDNA不含内含子，不需要转录后加工。

3、与原核多肽形成融合蛋白（克隆到一段原核基因下游，形成融合蛋白后即可避免被原核细胞的蛋白酶降解）。 

 通过这些方法即可实现真核基因在原核细胞中的表达。

（一）启动子的选择

基因要进行有效的表达，最基本的要求是要有一个强有力、可调控的启动子。强有力的启动子可与RNA聚合酶紧密结合，带动下游的基因进行高效转录；启动子的可调控性（指可通过诱导物或者阻遏物诱导或阻遏其与RNA聚合酶的结合（或者通过温度的调节来完成该过程，如λ噬菌体的P_L启动子），从而调节转录），是为了精确地控制基因的转录速度及开始转录的时间。

常用的启动子见第八章，如Lac、Tac等。

（二）大肠杆菌的密码子偏爱性及密码子正确选择

大肠杆菌基因密码子的使用频率和真核基因中密码子的使用频率是不同的（偏嗜性不同，真核细胞中的常用密码子可能在大肠杆菌中是不常用的，反之亦然）。如外源真核基因富含大肠杆菌罕用密码子，则很难在大肠杆菌细胞中得到有效表达。

有两种策略可使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：

（1）更换同义密码子法。利用密码子的简并性，将真核基因中的某些密码子更换为大肠杆菌偏嗜的密码子。

（2）外源基因和相关tRNA同步克隆法（将与外源真核基因中某些密码子（大肠杆菌中罕用密码子）翻译相关的tRNA基因克隆到另一个表达载体中，同时导入大肠杆菌中，构建大肠杆菌双质粒系统）。

二、大肠杆菌工程菌的构建策略

大肠杆菌中表达的外源蛋白有三种形式，即包涵体型、分泌型和融合型。

（一）包涵体型外源蛋白的表达

1、包涵体的组成和特点

以包涵体形式表达重组异源蛋白的优点：

①外源基因表达的蛋白质分离易达到高纯度和高浓度（经高速离心即可获得包涵体）。

②异源重组蛋白在大肠杆菌细胞内的稳定性主要取决于形成包涵体的速度（速度快则不容易被宿主的蛋白酶所降解）。

③以包涵体形式存在的外源基因表达产物没有活性（因为包涵体的形成是由于多肽链的错误折叠形成的，因此没有活性，必须经复性之后才有活性），对于那些有毒性的表达蛋白来说，以包涵体形式存在则使宿主细胞免受伤害。

2、重组异源蛋白包涵体表达系统的构建

其方法简单来说就是将外源基因插入到原核表达载体强启动子和有效的S-D序列的下游，表达产物位于胞内，氨基端和羧基端不含有其他蛋白或多肽序列（不能含有信号肽序列，防止其分泌出去）。具体来说：

（1）通过一般重组、PCR扩增甚至化学合成等方法将强启动子和S-D序列按照最佳间隔及碱基序列连为一体，组成大肠杆菌表达复合元件

（2）避免在S-D序列与外源基因的起始密码子或之间引入过多的碱基对（即要注意外源基因与S-D序列之间的距离）。

（3）保证各组件之间的顺序和连接方向（如启动子要在S-D序列之前，S-D要在ATG之前），同时加入合适的酶切位点，利于表达载体构建和酶切鉴定。

（二）分泌型异源蛋白的表达

1、分泌型异源蛋白表达的特点

①异源蛋白分泌到周质（细胞内外膜之间的空间），能够有效的浓缩和纯化（因为只有具有信号肽的蛋白才能到达周质中，因此周质中的蛋白含量较少）。

②周质中蛋白酶少，异源蛋白更稳定。

③周质微环境（处于氧化状态），利于二硫键形成和蛋白质正确折叠

④异源蛋白易于正确切割（分泌到周质中后可切除信号肽及N端的甲硫氨酸残基），形成正确的目的蛋白。

（蛋白的分泌机制见教材。）

2、分泌型异源蛋白的表达系统的构建

将大肠杆菌分泌型蛋白的信号肽序列拼接到外源基因的5’末端，如pINⅢ-ompA就是将大肠杆菌的外膜蛋白A的信号肽序列连接在MCS前构建的。

常用信号肽（大部分为原核生物的）：

①大肠杆菌的碱性磷酸酶、外膜蛋白、LamB蛋白、内酰胺酶

②金黄色葡萄球菌蛋白质A

③枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶、

④胡萝卜欧氏杆菌的果胶酸裂解酶B

⑤鼠源RNase、人生长素信号肽等

（三）融合型异源蛋白的表达

将外源基因与受体菌自身蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一套阅读框架进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。（通常N端为宿主菌的蛋白部分，C端为外源蛋白）。

1、融合型异源蛋白表达的特点

①稳定性大大增加（融合之后可封闭外源蛋白的蛋白酶作用位点）。

②分离纯化程序简单（利用标签蛋白的抗体即可纯化）。

③表达效率较高（所用标签蛋白都是可高效表达的蛋白）。

2、融合型异源蛋白表达系统的构建

原则

①受体细菌结构基因应能高效表达，产物可进行特异性简单纯化。

②外源基因应插入受体菌结构基因的下游区域，并为融合蛋白提供终止密码子（也可在载体的多克隆位点下游添加终止密码子）。

③尽可能避免融合蛋白分子中两种组分的分子量大小过于接近，为分离回收创造条件（如酶切后蛋白电泳分离）。

④两个结构基因拼接位点处的设计（如采用酶切位点连接还是通过Linker连接，这与目的蛋白的回收有关）。

⑤为确保异源蛋白序列的完整性，通常将受体菌蛋白编码序列设计成3种阅读框架，构成3种相应的融合蛋白表达质粒（可将外源基因同时连接三种载体，其中肯定有一种是正确连接的，如pET30a、b、c）。

（四）提高大肠杆菌中外源基因表达效率的策略

除了第八章介绍的方法外（如选择强启动子、调整S-D序列与ATG之间的距离等），还可以通过以下几种方法提高表达效率：

1、寡聚型外源蛋白的表达

构建寡聚型异源蛋白表达载体，是将多拷贝的外源基因克隆在一个低拷贝质粒上，而不是单拷贝外源基因在高拷贝载体上的表达。即将同一外源基因制备多个拷贝，连接在一个载体上进行表达。

寡聚型外源蛋白的表达，包括3种不同的重组策略：

（1）多表达单元型重组：同一外源基因的每一个拷贝均具有各种转录和表达元件（如启动子、终止子、S-D序列等），串联于同一个载体上。主要适用于分子量较大的异源蛋白

（2）多顺反子型重组：外源基因的每一个拷贝含有各自的表达元件，如S-D、ATG等，但共用一个启动子和强的转录终止子，转录的mRNA为多顺反子，主要适用于中等分子量的异源蛋白

（3）多编码序列型重组：多个拷贝共用一套转录和表达元件，主要适用于小分子多肽。

2、整合型外源蛋白的表达：

在非选择性培养基中培养时，少量的重组子可能会丢掉质粒成为非转化子，这种菌的生长繁殖较快，逐渐占优势，从而使重组子的含量降低，从而降低目的蛋白的产量，实验室中可加入抗生素淘汰丢失重组质粒的宿主菌，然而大规模生产中添加抗生素不经济。为了防止重组质粒的丢失，可构建整合性外源蛋白表达系统。

将外源基因直接整合在受体细胞染色体DNA的特定位置上，使之成为染色体DNA的一个组成部分，从而增加其稳定性（外源基因的两侧带有与宿主菌染色体DNA同源的部分）。

3、构建蛋白酶抗性或缺陷型表达系统：

目的蛋白在宿主菌中表达后可能会被宿主菌的蛋白水解酶降解掉一部分。

（1）细胞内蛋白降解的基本特征

细胞内蛋白降解的一个重要特征是其显著的选择性：不同的蛋白水解酶识别不同的多肽序列和空间结构。

（2）蛋白酶缺陷型受体细胞的改造

在大肠杆菌中，蛋白的选择性降解由一整套庞大的蛋白酶系统所介导。很多异常或异源蛋白在大肠杆菌中的降解还直接与庞大的热休克蛋白家族（是一种分子伴侣）的生物活性有关。可构建这些蛋白的编码基因缺陷的宿主菌用于表达目的蛋白，从而提高其稳定性。

（3）抗蛋白酶的重组异源蛋白序列设计

C端极性氨基酸（如天冬氨酸等）的存在可能会提高蛋白质的稳定性，C端含有非极性氨基酸则对蛋白酶敏感。

蛋白质N端序列对稳定性的影响同样显著，通过改造N端序列也可以增加稳定性，如N端加上组氨酸、半胱氨酸等。

三、基因工程菌遗传不稳定性及其对策

基因工程菌若稳定则能不断得到蛋白产物，然而实际生产中，多次传代后，宿主菌可能会发生退化，如重组子可能退化为非转化子（失去重组质粒），这就是其遗传不稳定性。

（一）工程菌遗传不稳定性的表现与机制

不稳定性的主要形式：（1）重组DNA分子某一区域发生缺失、重排或修饰（产物发生改变）。（2）整个重组DNA分子不稳定，从而使部分重组DNA分子子代细胞不带质粒（变为非转化子）。

（二）改善工程菌不稳定性的对策

1、改善载体宿主系统：即构建稳定性宿主表达系统

2、施加选择压力：如利用抗生素加压、利用基本培养基培养（含重组质粒（该质粒含有基本培养基中所缺乏的营养物质的编码基因）的营养缺陷性宿主菌可生长，丢失质粒后即不能生长）等。

3、控制外源基因过量表达：外源基因过量表达也可能导致工程菌不稳定，可通过使用诱导型启动子控制其过量表达。

4、优化培养条件：如培养时间、培养温度等。

5、固定化：将宿主菌固定化后进行培养其稳定性较好。

四、细菌表达异源蛋白的流程

初级培养即种子培养；次级培养即产生一级种子；初级发酵即获得二级种子；产品发酵即在发酵罐内发酵生产，产物如为包涵体形式的则要取沉淀破碎细胞后经复性后纯化产物；若为分泌型的则可直接取上清纯化蛋白。