外源基因在真核细胞中的表达

真核细胞主要指酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。

真核表达载体一般都含有真核或病毒启动子、MCS、终止子。除此之外还有选择性标记、复制起始点等。

一、在酵母中表达

1、酵母克隆载体

① 能在E.coli中克隆和扩增：含有大肠杆菌的复制起始点。

②有大肠杆菌的选择标记：如Amp^r、Tet^r。

③ 有酵母的选择标记：如Leu+（亮氨酸）、His+（组氨酸）等（即载体上含有编码Leu、His的基因，可通过基本培养基进行筛选，所用宿主酵母菌是缺乏这些基因的酵母菌）

④ 有合适的克隆位点。

（1）整合型载体：由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断（选择标记）构成。如 PYeleu10由大肠杆菌ColE1质粒和酵母Leu+（亮氨酸）基因组成。

特点：①转化率低（1-10转化子/微克DNA）。

②不能在酵母细胞中自主复制：载体上只有细菌的复制区，没有酵母的自主复制区。

③整合到酵母的染色体上: 可与受体细胞的染色体DNA同源重组，随细菌染色体一起复制。

④不能从酵母细胞中提取载体。

（2）复制型载体：即YRp质粒

由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段（选择标记和酵母DNA自主复制序列ARS）构成。

特点：

①转化率高（10²-10³转化子/微克DNA) 。

②可从大肠杆菌和酵母中提取质粒：不整合。

③穿梭载体：既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母细胞中自主复制。

④不稳定，容易丢失。

（3）着丝粒载体（YCp） 

在复制型载体中插入酵母染色体的着丝粒区（着丝粒是有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点， 使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中）。

特点：①行为像染色体，能稳定遗传。

②单拷贝存在。③不易从细胞中提取。

（4）附加体型载体（YEp）

由大肠杆菌质粒、2mm质粒及酵母染色体DNA选择标记构成。如pYF92

2mm质粒：酿酒酵母的内源质粒，长度是2mm 。含有自主复制起始区ori和STB序列（使质粒在供体中维持稳定），因此附加型载体含有2mm质粒实际上就具有了酵母菌的复制起始区和STB序列，实际上也是一种穿梭载体。

特点：①很高的转化活性（10^3-10⁵转化子/微克DNA）。

②拷贝数多（25-100分子/细胞）。③比YRp稳定。

除了上述载体外还有酵母人工染色体（YAC），查资料自学。

2、酵母转化和表达的一般过程：见PPT图 

3、酵母表达系统的特点 

（1）优点

①对其遗传学和生理学的研究比较深入（单细胞真核生物，较简单）。

②小量培养和大规模反应器中都能生长。

③已经分离出很强的启动子。

④有翻译后的加工。

⑤本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯化。

⑥安全性高，不需要宿主的安全性检验。

（2）缺点

①表达量普遍低：不如原核表达。

②常常发生质粒丢失：不稳定。

③重组蛋白常常超糖基化：每个N-寡糖链上含有100多个甘露糖，而正常的高甘露糖寡糖链上仅有8-13个甘露糖。

④分泌困难：不容易获得分泌型的蛋白，胞内表达的比较多，但毕赤酵母表达系统较容易获得分泌性蛋白。

4、在啤酒酵母中表达的重组蛋白：主要是一些预防、诊断、治疗用的生物制品。

5、在啤酒酵母中表达外源蛋白的方式

（1）细胞质内表达

如人SOD在酵母中表达：表达出的SOD需要进行修饰（因此不能用原核表达系统表达），其修饰包括起始氨基酸被切掉，第二个氨基酸丙氨酸也被乙酰化。

（2）表达分泌型蛋白

在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白质才能被糖基化。        需要糖基化的重组蛋白必须是分泌蛋白。（在细胞质内表达的蛋白不能被糖基化）

获得分泌蛋白的方法是构建合适的载体：加入前导肽，即信号肽，在重组蛋白的前面加一段酵母菌的前导肽，与重组蛋白的N端通过Lys-Arg（赖氨酸-精氨酸）相连。

信号肽的切割：当蛋白质分泌到壁膜间隙时，酵母菌的内切蛋白酶识别这个切点信号，把重组蛋白正确切下来。切下来的重组蛋白即可发生糖基化。

除了啤酒酵母外还有其它的酵母表达系统，如毕赤酵母表达系统、嗜甲烷酵母表达系统等（查资料自学）。

二、昆虫细胞表达系统

1、杆状病毒转化载体：该表达系统所用的载体是杆状病毒载体。但是杆状病毒的基因组太大（13kb环状DNA），不能直接插入外源基因。所以必须构建转移载体，使用同源重组的办法将外源基因导入杆状病毒中。

载体在大肠杆菌质粒中插入两段杆状病毒序列以供同源重组，含有多角蛋白的启动子和终止子及polyA加尾信号，在启动子与终止子之间插入多克隆位点。（多角体病毒是杆状病毒的一种）

2、最普遍应用的宿主细胞株

源自草地夜蛾的细胞株（sf9、sf21）在这种细胞中，多角蛋白的启动子特别活跃。

3、杆状病毒载体转化过程

① 转移载体中插入外源基因

② 转移载体与野生型AcMNPV DNA共转染宿主细胞

③ 转移载体与病毒基因组发生交换

④ 外源基因被交换转入病毒基因组中

⑤ 重组病毒侵染宿主4-5天后即可收获重组蛋白。

4、转化子筛选

多角体基因被外源基因取代后，病毒仍然能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形成多面体，通过显微镜检查看是否有多面体形成。不能形成多面体的为重组病毒，形成多面体的为非重组病毒。

6、昆虫杆状病毒表达系统的优点

（1）可插入较大基因（可达38 kb ），可采用双启动子（许多表达载体均可采用双启动子，可在两种细胞中转录表达），表达多个目的基因。

（2）转导效率高、表达水平和稳定性高；

（3）可进行翻译后修饰。（为真核表达系统，可糖基化、磷酸化等）

（4）可以用于瞬时表达分析或稳定转染表达分析；

（5）杆状病毒具有高度的种属特异性，对脊椎动物和植物均无致病性，生物安全度高。

7、杆状病毒大规模表达存在的问题

（1）宿主细胞寿命短：感染4-5天后宿主细胞裂解或幼虫死亡。

（2）共转染率低：重组率更低，只有0.1%-1%。

8、构建可持续表达的载体：

利用AcMNPV的一个早期基因IE1的启动子。

IE1基因的转录不依赖与病毒的其他基因产物，而且在昆虫细胞中表达正常。把外源基因插入到IE1启动子和IE1终止子之间。构成整合型载体。载体转染宿主细胞后随机整合到宿主染色体上，实现外源蛋白的持续表达。

三、外源基因在植物中表达

1、Ti质粒: 存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒。

Ti质粒的结构：环状双链DNA，1.5×10⁵-2.0×10⁵bp（185kb），(相当于细菌染色体的3%-5%）。

①T-DNA：转移DNA，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的染色体上。长度一般为12-24kb，是Ti质粒最重要的部分。

②毒性基因（vir）：决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转移， 进入和整合。vir的产物能诱导Ti质粒产生T-DNA区域的单链拷贝。单链拷贝从Ti质粒脱离后，可与vir的产物VIR D2蛋白结合，并可穿过农杆菌内膜、外膜、壁和植物细胞壁、细胞膜及核膜，最后整合到植物染色体上。

2、Ti质粒转化的对象：裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶植物（玉米）。

3、Ti质粒作为载体的可能性：

（1）能够自发地整合到植物的染色体上。

（2）能转化多种植物。

（3）强启动子：T-DNA的opine合成酶基因上有一个强启动子，能启动外源基因的表达。

4、天然Ti质粒作载体的缺点：

（1）分子量太大（200kb）！

（2）限制性酶切位点太多。

（3）被转化的植物细胞成为肿瘤，不能再分化。

（4）在大肠杆菌中不能复制。

5、Ti质粒的改造

（1）保留T-DNA的转移功能部分（vir基因，左右边界）。

（2）减少限制性酶切位点，引入单一插入位点。

（3）取消T-DNA的致瘤基因，使被转化的植物细胞不再成为肿瘤，能正常分化。

（4）冠瘿碱合成对于植物无意义，应剔除掉。（冠瘿碱是在冠瘿瘤内合成并分泌出来的，是农杆菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠瘿碱。）

（5）加入大肠杆菌的ori和选择标记。

（6）加上真核生物的转录信号和终止信号以及添加polyA的信号序列（polyA转录后形成U串，可终止转录）。

至于Ti载体的种类、构建过程，转化、表达见第十章植物基因工程。

四、在哺乳动物细胞中表达

与其它表达系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。

哺乳动物细胞表达系统主要用于构建疫苗和基因治疗。

（一）、表达载体的类型：根据进入宿主细胞的方式，可将表达载体分为病毒载体与质粒载体。  

1、病毒载体：病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内（与病毒的自然感染进入细胞的方式一样）。常用的病毒载体有腺病毒载体、痘病毒载体、逆转录病毒载体、杆状病毒载体等。 

（1）痘病毒载体：特点是

①宿主范围广；（几乎可感染所有的哺乳动物细胞）

②增殖滴度高；（病毒复制较快）

③稳定性好；（传代不容易丢失外源基因）

④非必需区基因多。（可插入大片段）

如HIV-1主要囊膜蛋白（gp120）重组痘病毒，已进入临床试验。   

（2）腺病毒载体

①腺病毒比较安全：是一种比较温和的感冒病毒。

②靶细胞范围广，可感染造血细胞干之外所有的人类细胞。

③容易制备，对热不敏感，在适合的培养系统中呈高滴度增殖。

④人类腺病毒Ad2、Ad5等启动子较强，能高水平表达外源基因，特别是换以更强的启动子如CMV（巨细胞病毒）早期启动子后，更可明显提高外源基因的表达水平。

（3）杆状病毒载体

① 操作容易，实验流程简单快捷，重组病毒易于构建,容易获得高滴度病毒粒子；

② 转导效率高、表达水平和稳定性高；

③ 对细胞只有微小的毒性或没有毒性，杆状病毒的转导不影响细胞的生长；

④ 可以用于瞬时表达分析或稳定转染表达分析；

⑤ 杆状病毒可通过昆虫细胞大量制备病毒颗粒，可感染多种哺乳动物细胞，但在细胞内无复制能力（只进行表达，不会整合），生物安全度高。

⑥ 可承载的外源片段可以大到38 kb，可以同时插入几个不同的基因。 

主要作为研究疫苗的载体和基因治疗的载体，基因治疗是指向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片断，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。

2、质粒载体

哺乳动物细胞质粒表达载体包含原核序列（包括能在大肠杆菌中自身复制的复制子，便于筛选重组菌的抗生素抗性基因，以及便于目的基因插入的限制性酶切位点）、真核生物启动子（如CMV启动子等）、增强子、病毒DNA的复制起始点及复制相关蛋白、终止子和多聚核苷酸信号等。

pcDNA3.1(+)载体具有多克隆位点，有高效能稳定和瞬时转染哺乳动物及人类细胞的能力，具有高效率CMV立即早期启动子和增强子、T7启动子、BGH多腺苷酸信号（牛生长激素基因的多腺苷酸序列）、SV40早期启动子、SV40复制起点、pUC复制起点和f1噬菌体的复制起始点。

pcDNA3.1(-)与pcDNA3.1(+)的区别在于两者的多克隆位点方向相反。

小结

1、真核表达载体一般都含有真核或病毒启动子、MCS、终止子。除此之外还有选择性标记、复制起始点等。

2、酵母克隆载体包括整合型载体、复制型载体、着丝粒载体、附加体型载体能够。

3、酵母表达系统具有强的启动子、有翻译后的加工、便于胞外蛋白的纯化等优点，因此应用较广。

4、昆虫杆状病毒表达载体可插入较大基因、转导效率高、表达水平和稳定性高、可进行翻译后修饰、可以用于瞬时表达分析或稳定转染表达分析、生物安全度高，主要用于制备疫苗和基因治疗。

5、哺乳动物表达载体根据进入宿主细胞的方式，可将表达载体分为病毒载体与质粒载体。