真核生物基因重组筛选方法

上述筛选方法既适合于原核基因也适合于真核基因，此外，真核基因还有一些其他的筛选方法，都与真核基因的一些特殊筛选标记有关。

哺乳动物基因转移的选择标记

1、胸苷激酶（tk基因编码）：

（1）TK选择原理：

①四氢叶酸的必要性：真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。四氢叶酸是在二氢叶酸还原酶的作用下由二氢叶酸转化而来的。

②氨甲喋啉的抑制作用：

氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似物。能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断dATP、dGTP和dTTP的合成。嘌呤核苷酸的从头合成途径中需要甲基才能合成次黄嘌呤IMP，最终生成两种嘌呤核苷酸。氨甲喋啉抑制了二氢叶酸还原酶，从而就阻止了四氢叶酸的合成，因此不能合成IMP，最终不能合成dATP和dGTP。dUMP也需要被四氢叶酸甲基化后才能生成胸腺嘧啶核苷酸dTTP。

③次黄嘌呤的补救作用：培养基中如果有次黄嘌呤，哺乳动物细胞则可以直接利用次黄嘌呤合成dATP和dGTP（但是没有dTTP细胞仍不能存活）。

④胸苷酸激酶的补救作用：TK⁺细胞（含有tk基因）能产生胸苷酸激酶，所以可以利用培养基中的胸苷（T）合成TTP，进而合成dTTP，同时又通过次黄嘌呤合成dATP和dGTP，所以能存活。

（2）TK选择过程

① HAT培养基：含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基。

② 宿主细胞：TK^-细胞株。

③ 载体标记：tk基因，即载体上带有此基因。

只有转入tk基因的细胞才能生存（只有含有带tk基因的载体时才能存活）。

如：将SV40载体（或者含有目的基因的该载体）转染在HAT培养液中培养的TK^-宿主细胞，转染成功的细胞中SV40的tk基因整合如宿主细胞的基因组中，这种细胞能存活下来，而未转染的细胞则被淘汰掉。

2、二氢叶酸还原酶基因（DHFR）

（1）选择原理：

①二氢叶酸还原酶的必要性：真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。二氢叶酸还原酶可合成四氢叶酸

DHFR⁺细胞能产生二氢叶酸还原酶，能合成四氢叶酸。能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存，故不需补救！

反之DHFR- 细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所以不能合成四氢叶酸，不能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存，需要补救！

② 胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救

当无四氢叶酸提供甲基，同时dNTP合成受阻时，胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救。

（2）选择过程

① 宿主细胞：DHFR-细胞株（不能在无核苷酸的培养基中生长，可在含有核苷酸的培养基中生长，因为可以直接利用培养基中的核苷酸）。

② 无核苷酸的培养基：透析除去血清中的内源性核苷酸，以免补救。

③ 氨甲喋呤“加压” ：添加少量氨甲喋啉抑制内源性DHFR的补救作用，可提高选择。

④ 载体标记：含有DHFR⁺基因。

只有转入DHFR⁺基因的细胞才能生存（只有转入这种载体的细胞才能生存）。

3、新霉素抗性基因（neo^r）

（1）选择原理：① 新霉素：是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，使细菌的蛋白质合成不能正常进行，但不影响真核生物（两者的核糖体不同）。

② G418：新霉素的类似物，是一种 氨基糖苷，对真核细胞和原核细胞都有毒性。

③ 新霉素抗性基因—neo^r：细菌的新霉素抗性基因（neo^r）编码一种磷酸转移酶（APH），能使G418失活。因此未被转染的真核细胞在G418的作用下死亡，而被转染的真核细胞则存活下来。

（2）选择过程

① G418培养基：含致死剂量G418：（100-800mg/mL）的完全培养基。

②宿主细胞：真核细胞株均可。

③载体标记：新霉素抗性基因。

4、氯霉素乙酰转移酶（CAT）

（1）选择原理：CAT是由大肠杆菌转座子Tn9编码的，催化氯霉素发生乙酰化失活。

（2）选择条件：含氯霉素的培养基。

（3）宿主细胞：真核细胞株均可。

（4）载体标记：cat基因。

（5）CAT分析方法：① 分析乙酰氯霉素：在转化的细胞提取物中测定是否有乙酰氯霉素（被转染的细胞含有，未被转染的细胞不含）。

② 免疫学检查：用抗CAT的血清进行Western blot或ELISA，检查CAT的表达。