DNA序列分析法

DNA 序列测定是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的。可分离相差仅1个碱基的核酸分子。 常用测序方法有双脱氧末端终止法和化学裂解法。

双脱氧末端终止测序法的基本原理： 

四个反应管中，在 DNA 聚合酶催化下，以单链 DNA 为模板，加入单引物、四种dNTP ，以及每管中加入双脱氧核糖核苷酸 ddNTP双脱氧核苷酸 (ddNTP) 的 5’端是正常的，而其 3’端-OH 则没有，因此不能连接其后继核苷酸形成磷酸二酯键，于是链的延伸至此结束。引物在 DNA 聚合酶的催化下，按碱基互补原则逐步在引物的3’端加上四种脱氧核糖核苷酸，四个反应管中的ddNTP 随机地与dNTP 竟争结合位点，于是引物延伸链随机终止在各个可能位点，在电泳图谱上形成一系列相差一个核苷酸的单链DNA 梯带。经过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，根据电泳图谱即可拼出所测 DNA 序列。 

转译筛选法

借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。

适用于mRNA转录丰度高的外源基因。

一、无细胞翻译系统：能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提取物。如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。

二、转译筛选：首先将重组质粒转录为mRNA，利用无细胞翻译系统（加入³⁵S标记的甲硫氨酸ATG）进行翻译，这样就得到ATG为³⁵S标记的肽链，然后进行PAGE电泳，经放射自显影后比较放射性带纹的位置就可以知道与预期的产物分子量相符。

操作方法又包括杂交抑制转译法、杂交释放转译法等。

三、杂交抑制转译法

1、原理：mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。

2、过程：提取细胞总mRNA，反转录为cDNA，插入载体，转化后培养。提取质粒，与总mRNA进行杂交。然后利用无细胞翻译系统进行两个体外翻译，一个对杂交的质粒进行翻译，一个对总mRNA进行翻译，翻译后同时进行PAGE电泳，放射自显影后比较带型，与总mRNA翻译后相比，没有的条带对应的质粒就是重组质粒。

四、杂交释放转译法

1、原理：将载体上克隆的cDNA与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应的mRNA，进行体外转录。

用于研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物。

2、过程：将重组质粒转移到NC膜上，加入总mRNA，与目的基因对应的mRNA就与之杂交，其他的mRNA被滤过，洗涤后在用洗脱液将mRNA洗脱下来，利用无细胞翻译系统进行体外翻译（加入³⁵S标记的甲硫氨酸），电泳后自显影即可。