免疫化学检测法

对表达产物的检测（即是一种间接的筛选方法），主要利用特异性抗体与外源DNA编码产生的抗原的相互作用进行筛选，实际上就是蛋白—蛋白“杂交”。即利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。

    使用该法的前提是：插入的外源基因必须在受体细胞中表达，并且具有特异性的抗体。

    常用的免疫检测法有放射性抗体检测法、免疫沉淀检测法、ELISA和Western印迹等

一、放射性抗体检测法

1、抗体与产物的结合方式

根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：（见PPT）

2、基本原理：

①一种免疫血清含有好几种IgG抗体，它们识别抗原分子上的不同部位，并分别同各自识别的抗原相结合；

②抗体分子或抗体的Fab部分，能够十分牢固地吸附在固体基质(如聚乙烯等塑料制品)上，而不会被洗脱掉；

③通过体外碘化作用，IgG抗体便会迅速地被放射性同位素¹²⁵I标记上。

3、放射性抗体检测法过程（略）。

4、Broome-Gilbert双位点检测法

可用于检测融合蛋白（如GST融合蛋白，His融合蛋白），也就是既检测外源基因产物又检测载体基因产物。

检测所用的一抗是抗标签的抗体，不论外源基因如何，均可使用此一抗，只需制备不同的标记二抗即可（见PPT图）。

二、免疫沉淀检测法：

主要检测分泌型产物（外源基因在宿主宿主内的表达形式有分泌型的也有包涵体型的）。

1、原理：抗原抗体的沉淀反应。

2、方法：把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。

对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶）。

三、酶联免疫吸附测定（ELISA）

1、原理：

一抗（primary antibody）: 与目的蛋白特异结合。

二抗（secondary antibody）：与一抗的特异性结合。

二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质，再通过比色测定有色物质的含量（或吸光度），从而检测目的蛋白的存在。

2、ELISA检测的一般步骤

（1）固定样品（即包被）：将待测样品用包被液稀释后加入96孔包被板的孔中，4℃、室温或37 ℃湿盒内包被过夜，抗原即可就被固定在孔底。

（2）一抗结合：加入一抗反应后冲洗掉未结合的抗体。

（3）二抗结合：加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗，不与待检抗原结合。二抗上联着一种酶（辣根过氧化物酶HRP、碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。

（4）显色反应：加入无色的底物（如邻苯二胺OPD），被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。

（5）比色：在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。（OD450或OD492等）。

常用的是间接法，用抗原检测抗体，抗原包被一般1~10微克即可，但需要摸索。除了间接法外还有双抗夹心法、竞争法、捕获ELISA等。

3、ELISA的局限性：有效，但敏感性、特异性稍差（主要取决于一抗的特异性）。必须与其他方法一起综合考虑。因此最好用单克隆抗体提高其特异性。

四、免疫印迹（western blotting）法

在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。

1、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳  

（1）SDS:十二烷基磺酸钠。是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。从而在电场作用下移动。

（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：

在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短，与蛋白质的以及结构有关），从而把不同分子量的肽链分开。

（3）蛋白Marker：已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。商品化供应. 道尔顿(质量单位, 等于一氧原子质量的十六分之一。

一克约为6×10²³道尔顿.

（4）凝胶中的蛋白质染色：

① 直接染色：考马斯亮蓝染色灵敏度底、只能检出>0.3-1μg/带，但可褪色回收。硝酸银染色灵敏度高、可检出2-5ng/带。

② 转到膜上进行染色。

2、Western blotting

（1）Western（转膜）：电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、中性尼龙膜等）。

胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上（因为蛋白质带负电）。装置与Northern一样。

（2）Blotting：原理与ELISA相同。只是在膜上进行，将一抗、二抗稀释后加入平皿中，将膜在放入平皿中作用即可。

（3）Blotting过程

① 先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与膜上的蛋白结合。（多抗也可以）

② 洗去未结合的一抗。（用Tris即可）

③ 用二抗与一抗结合（二抗上带有HRP）。

④ 清洗掉未结合的二抗。

⑤ 用显色液（OPD）浸泡膜。

⑥ 加入水，终止反应

（4）结果：单抗特异性好，条带单一，多抗特异性差，常有杂带。