物理检测法－电泳检测法

一、直接电泳检测法

1、基本原理：

    质粒的电泳速率与其分子量成反比，因此分离质粒DNA并对其进行电泳，带有外源基因的重组DNA分子的迁移率要低于无外源基因的质粒分子。 

    2、操作：

将含有质粒的单菌落细胞破碎，提取其质粒DNA，用琼脂糖凝胶电泳，观察其电泳图谱，判断含有插入序列的重组质粒。

二、酶切电泳筛选法

根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。

实际操作中一般是通过表型加酶切方法筛选。先转化含抗生素的平板，然后随机挑菌提质粒，电泳（加空载体对照），选择分子量大的酶切。

三、PCR扩增检测法

1、原理：PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片段。

2、过程：

（1）从转化菌中提取质粒（或DNA）。

（2）用外源DNA插入片断引物作PCR。

（3）电泳PCR产物。

（4）检查是否有PCR产物。

（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。

3、菌落PCR：是直接以转化菌的单个克隆为模板,通过特异性引物或通用引物对插入载体中的目的基因快速扩增，用于鉴定和筛选阳性转化菌的技术。与传统的鉴定方法相比,由于其具有快速、经济、简便的特点而被广泛用于转化菌、特别是大量转化子的鉴定和筛选 。

菌落PCR与获得目的基因时所用常规PCR的区别在于前者预变性时间长，退火温度高、循环数少。

预变性时间延长为10 min, 使得细菌能够充分破裂，DNA 大量释放并充分变性。

退火温度提高是由于原来引物中的酶切位点和保护碱基与待扩增的基因是不配对的，现在（做菌落PCR时）配对的数量增多，退火温度越高，特异性越强 。

循环次数减少是因为25～35个循环的扩增量足够进行检测，如果量太大跑出的电泳条带呈现︼型，不易确定分子量。

菌落PCR出现假阳性：（非重组子扩增出条带）

样品污染、扩增试剂污染、扩增产物交叉污染等。常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操作中形成的喷雾、 试剂及任何与扩增产物接触的东西。

菌落PCR出现假阴性：

避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物理原因（变性、退火的温度、时间）。

一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽,形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带，多数不太亮,条带细而且不规则，有时拖尾。因此为了避免出现假阳性和假阴性结果，操作时需设阳性对照和阴性对照。

菌落PCR的操作过程：

（1）菌落PCR完毕后电泳检测带型，在LB平板上挑选有正确带型的菌落。

（2）阳性克隆提取质粒

（3） 酶切检测条带的分子量。

（4） 测序，检查点突变（此为最准确的鉴定该方法）。