第七章  重组子的筛选和鉴定

    由于重组率和转化率不可能达到理想极限（连接效率不可能100%，转化时有些细胞能被导入外源DNA，有些不能），因此必须借助各种筛选和鉴定方法，区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。

例如：连接产物转化细菌时，不可能所有的细菌个体都能被导入连接产物，如果涂布时所用平板不含抗生素，那么长出的菌落有些就是非转化子（不含任何外源基因的感受态细菌），平板上加入抗生素就是筛选转化子的一种方法。

所谓转化子是指：导入外源DNA后获得了新的遗传标志的受体细胞。

重组子筛选和鉴定常用方法有遗传学检测法、核酸分子杂交检测法、物理检测法等。

遗传学检测法

重组子由两部分组成——载体和目的基因。因此可根据载体和插入基因的遗传学性状进行检测。

一、根据载体表型筛选

（一）、抗药性标记及其插入失活筛选法（以PBR322为例）

1、原理：pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因：Tet^r和Amp^r。 Tet^r上有插入位点BamH I和Sal I; Amp^r上有插入位点Pst I

2、pBR322抗菌素标记选择

（1）四环素：抑制细菌生长，但不杀死细菌。

（2）氨苄青霉素抗性基因：产生b-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I₂-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色，变为白色。

（3）环丝氨酸：有时培养时培养基中会加入环丝氨酸，它可以杀死正在生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。

3、筛选方法：PBR322构建的重组质粒筛选方法有三种。

（1）四环素抗性插入失活筛选法：

如果在Tet^r上插入外源DNA（比如在BamHI位点上插入），导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。

Tet^r失活的菌（含有重组子的菌），其不能产生四环素抗性蛋白，因此其生长被四环素抑制（但不会被杀死），由于其不能生长，因此不会被环丝氨酸杀死，保留下来（环丝氨酸只杀死正在生长的细菌，但不能杀死停止生长的细菌），另外非转化子（重组质粒和空载体都不含有的菌）也被保留下来（也被四环素抑制而不被环丝氨酸杀死）。

Tet^r不失活的菌（含有空载体的菌）能抵抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死（一生长就被杀死）。因此经过这种培养基选择后保留下来的菌就是非转化子和重组子。

然后将这种平板上的表面影印到含氨苄青霉素的平板上（不含环丝氨酸），长出的菌落就是含重组子的菌落（非转化子被氨苄青霉素杀死了）。

（2）氨苄青霉素抗性插入失活筛选法

如果Amp^r上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。

首先连接产物涂布于含四环素的平板上，非转化子被杀死，长出的菌落都是转化子，有的含重组子，有的含空载体。然后在平板上加上碘-青霉素指示液进行选择，非重组子氨苄青霉素抗性基因编码的b-内酰胺酶使碘-青霉素指示液（蓝色）褪色，因此菌落仍保持白色，重组子不能产生b-内酰胺酶，因此使菌落染成蓝色，所以蓝色菌落为阳性克隆。也可在配置平板时直接在融化的固体培养基中加入四环素和碘-青霉素指示液，这样直接涂板，长出的蓝灰色菌落即为阳性克隆。

（3）影印平板筛选法：

若在Tet^r中插入外源DNA则：先将转化液涂布含有Amp的平板（非转化子不能生长，长出菌落的都含有空载体或重组质粒）；再将Amp平板上的转化子影印至含有Tet的平板上（含重组子的菌不能生长，含非重组子的菌可以生长）；两个平板对比，在Amp平板上生长、但在Tet 平板上不长的转化子即含有目的重组子。

反之，若外源基因插入AMP^r中，则先涂布四环素平板，再影印到氨苄青霉素平板上。

注意：外源基因必须插入这两个抗性基因其中一个中才能利用以上方法进行筛选。如果两个抗性基因同时遭到破坏，那就无法选择（无法区分转化子和非转化子）。另外，如果外源基因没有插入任何一个抗性基因中，那只能进行初步筛选（只能区分转化子和非转化子，重组子和非重组子的区分还需要其他方法，如酶切鉴定等）。

（二）显色筛选法

1、基本原理：

    显色筛选法可以区分转化子与非转化子（涂布含抗生素的平板淘汰非转化子），也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因（如b-半乳糖苷酶基因），其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应，α互补现象，见第四章基因工程载体）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等。

2、基本操作：

将外源基因克隆在pUC18的lacZ’标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Ap^r、lacZ^-，白色菌落（不能合成b-半乳糖苷酶，即不具有α互补现象，不能催化X-gal转变为蓝色产物）；而非重组子则呈Ap^r、lacZ⁺，蓝色菌落。

将转化后的受体细胞涂布在含有X-gal和乳糖诱导物IPTG的培养基中，培养一段时间后观察菌落颜色。

二、根据插入基因的表型筛选

利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择

1、弥补缺陷：如营养缺陷型筛选法

转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。

如受体菌为组氨酸缺陷型菌株，而目的基因是组氨酸基因，则含目的基因的重组子进入宿主菌后，宿主菌即可获得该基因，因此能在不含组氨酸的基本培养基中生长，可以淘汰掉非转化子和非重组子。

2、增加新性状：

使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。比如小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。将DHFR基因与载体连接后导入宿主菌中，则宿主均就可以在含有三甲氧苄二氨嘧啶的培养基上生长，而非转化子和非重组子则不能生长。