重组体导入受体细胞

受体细胞：能够摄取外源DNA并使其稳定维持、具有应用价值和理论研究价值的细胞。根据细胞的种类可分为三类： 原核生物受体细胞、植物受体细胞、动物受体细胞，实际上除了上述三类外还有真核微生物受体细胞（如酵母菌），后面这些可以统称为真核生物受体细胞。

1、原核生物受体细胞

特点：1）染色体裸露，便于外源DNA重组；2）基因组简单，便于进行遗传分析；3）单细胞生物，易于获得一致性受体细胞；4）培养条件简单，生长快，实验周期短。

主要原核受体细胞：有大肠杆菌，枯草杆菌，蓝细菌等

原核受体细胞主要应用于构建基因组文库、表达基因产物及保存和扩增目的基因。

2、植物受体细胞

特点：1）具有体细胞全能性，一个分离的活细胞在合适的条件下可分化成植株；2）具有坚硬的细胞壁，可以纤维素酶处理获得原生质体。

主要应用于转基因植物的研究。

3、动物受体细胞

特点：1）体细胞一般无全能性，只能分化到细胞株；2）生殖细胞、胚胎细胞等具有全能性，可分化培养成转基因动物。

主要应用于转基因动物，检测动物核酸疫苗的表达等。

一、重组体导入原核细胞

并不是所有的原核细胞都具有接受外源基因的能力，基因工程中所用的原核受体细胞称为感受态细胞。

（一）、感受态大肠杆菌的制备（以E.coli为例）

1、概念：处于能吸收外源DNA分子的生理状态的细胞。

2、目的：增加受体菌细胞膜的通透性。

3、菌种：使用丧失了限制体系的大肠杆菌（防止对外源DNA的切割）：如DH5α、JM109等。

4、制备原理

在0 ℃的CaCl₂ 低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，Ca²⁺使细胞膜磷脂层形成液晶结构，增加细胞膜的通透性。

转化时加入DNA后，Ca²⁺ 能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶的羟基－磷酸钙复合物，黏附在胞膜的外表面；42 ℃热激处理，细胞膜的液晶结构发生扰动，出现间隙，即可使外源DNA进入细胞内。

5、制备过程（略）

（二）、重组DNA导入原核细胞的方法：包括转化和转导两种方法。

1、转化：DNA分子通过与细胞膜结合进入受体细胞并在细胞内稳定维持和表达的过程，包括化学转化和电转化。

（1）化学转化（热休克法）：又称为CaCl₂法。

该方法简单，但转化效率（每mgDNA转化成功的细菌克隆数）不高（10⁶-10⁸/mgDNA）。

（2）电转化法：基本原理是在一定强度脉冲电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生暂时性缝隙或微孔，质粒或DNA重组分子便可由此微孔进入细胞实现外源基因的转移。特点是转化效率高（高于10⁹/mgDNA）。

操作过程非常快，但所用参数如电压、电容等要多次试验摸索才能得到较高的转化率。

（3）转化率

定义：转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。

例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为10⁸，即每微克pUC18中有10⁸个分子能进入受体细胞。如果一微克pUC18共有3×10¹¹个分子，也就是说，每3000个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞（10⁸/3×10¹¹）。

转化率的用途：

利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为10⁷/μg载体，经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得10⁴个重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？

若重组率为100%，则转化后产生10⁴个重组克隆需要：

10⁴ /（10⁷÷100）= 0.1 μg 载体DNA

（此处10⁷÷100是因为“经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍”）

考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为：

0.1 / 20% = 0.5μg 载体DNA

载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按10∶1的要求算出（5μg）。

影响转化率的因素：

①重组质粒：载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同。

载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的空载体超螺旋质粒低两个数量级。

插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低。

②感受态细胞  

a、生长状态：制备感受态时菌体OD值要控制在0.3~0.4。

b、必须在冰冷的条件下制备。

c、CaCl₂处理：要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。

d、储存感受态细胞要在-70℃以下。

e、使用感受态菌时必须在冰上融化：融化后一般不能再次冻存使用。

以上是将重组质粒导入受体菌的方法（所用的受体菌均为革兰氏阴性菌，如大肠杆菌），如果要将重组质粒导入革兰氏阳性菌则需要将受体菌制备成原生质体（没有细胞壁），因为革兰氏阳性菌的细胞壁会影响到DNA的导入。

而借助噬菌体载体将外源DNA导入细胞中的方法称为转导。

2、转导：重组DNA通过噬菌体蛋白或病毒蛋白包装成有感染能力的噬菌体或病毒颗粒而进入宿主细胞的方式。

①体外包装：把重组的噬菌体lDNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的l噬菌体颗粒。

②感受态细胞的培养：用液体培养基中培养至OD600 = 0.5左右。

③吸附：加入经体外包装好的重组噬菌体悬液，30℃保温10分钟

④转导裂解：加入新鲜培养基，30℃培养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选。

3、转化细胞的扩增

（1）、扩增操作：转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：Ca²⁺诱导转化后的37℃培养45min~1h，噬菌体转染后的30℃培养等，均属扩增操作。

（2）、扩增操作的目的：

①增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序；

②扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选；

③表达外源基因，便于筛选和鉴定。

二、外源基因导入真核细胞

1、借助于载体的基因转移（此处的载体不包括真核表达质粒）

主要是以动植物病毒、反转录病毒及植物农杆菌Ti质粒直接转染或转化受体细胞，把外源DNA引入。

优点：定向性好、效率高、重复性好

缺点：载体的侵染范围有限

2、磷酸钙共沉淀

（1）基本原理

将转移的DNA溶液与适量CaCl₂的溶液混合，再加入一定量的磷酸盐溶液，逐步生成DNA－磷酸钙沉淀复合物。将适量的该复合物加入细胞培养液中，通过细胞的胞饮作用进入细胞质或进而转移到细胞核内，然后整合到染色体上，或游离于细胞质中逐渐降解。

（2）操作步骤：

①DNA－磷酸钙沉淀复合物的制备。

②沉淀复合物向受体细胞的转移。

③后培养。

3、脂质体介导法：通过脂质体与DNA静电结合或直接将DNA包裹，并透过细胞膜把DNA运送到细胞内，实现外源基因的有效转染。

4、DEAE---葡萄糖传染法

二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）葡聚糖能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。DEAE带有正电荷，可以吸附带负电荷的DNA分子形成复合物，吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可以进入到细胞核里。

5、其他导入方法

（1）原生质体融合法：用酶去除微生物和植物细胞的细胞壁，形成原生质体，将外源基因与原生质体混合，在PEG（聚乙二醇）作用下使外源基因导入细胞。

（2）电穿孔法（即电转化法）：利用外加电场，击穿受体细胞的细胞壁和细胞膜，使重组DNA进入原生质体，通过筛选、诱导分化获得转基因植株。该法要求细胞膜的破坏不会造成对细胞的致命伤害。

（3）基因枪法：用被放电或机械加速的金属微粒轰击受体细胞，使吸附在金属微粒表面的重组DNA一起进入受体细胞。

（4）激光微束穿孔法：利用激光微束击穿细胞壁和细胞膜，引起细胞可逆性穿孔，使重组 DNA进入受体细胞内。

（5）显微注射法：利用显微注射仪直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。