重组DNA分子的构建

外源DNA片段同载体分子连接的方法，即DNA分子体外重组技术，主要是依赖于核酸内切限制酶和DNA连接酶的作用。一般说来在选择外源DNA同载体分子连接反应程序时，需要考虑到下列三个因素：

（1） 实验步骤要尽可能地简单易行；

（2）连接形成的“接点”序列，应能被一定的核酸内切限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段；

（3）外源基因必须在表达载体的启动子下，并置于正确的ORF中，以便目的基因的表达。

一、粘性末端的连接

DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起。

1、一种限制性核酸内切酶酶切的粘性末端间的连接：

优点：实验操作简单，易于回收外源DNA片段

缺点：（1）不易定向克隆。

（2）难插入特定的基因。

（3）大片段DNA的重组率低。

（4）外源片段和载体均易发生自身串联。

（5）目的片段自身各拷贝之间可能自连。

2、不同限制性核酸内切酶酶切的粘性末端的连接

用识别序列完全不同的一对限制性酶同时消化一个特定的DNA分子，将会产生具有两个不同粘性末端的DNA片段，并可使该片段按一定方向插入到载体分子上，当然载体分子需用同一对限制性内切酶处理。

另外，可应用同尾酶（识别序列不同，但末端相同），应用同尾酶的特点：连接后，形成的重组子不被原来的酶识别切割，但有时可被第三种酶的识别切割。但有时这样连接后不能被任何一种酶切割（如Sal I和Xho I），因此不利于回收DNA片段，所以用得较少，但构建基因文库时可用到（BamHI和Sau3AI）。

二、平头末端的连接

对于两个不能互补的粘性末端的连接，通常采用平头末端的连接方式，即先将其处理成平头末端，再连接，具有有两种情况。

（1）5‘突出末端的补平：大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow大片段

（2）3’突出末端的切平：T4噬菌体DNA聚合酶或S1核酸酶

平头末端连接的缺点：连接效率低、、双向插入及多拷贝插入。

1、直接连接：T4 DNA连接酶虽然能直接连接平末端形成磷酸二酯键，但效率很低，只有粘性末端的1%。

2、人工加尾形成 “粘性末端”，即同聚加尾法：1972年，斯坦福大学的P. Labban和P. Kaiser提出。

①原理：DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。

②加尾—碱基互补：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。

③优点：不易自身环化、连接效率高、所有DNA片段均可用此法。

④缺点：操作繁锁、外源片段难以回收、有可能影响外源基因的表达。

3、人工接头法

（1）衔接物(linker)连接

① linker：用化学合成法合成的一段8-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。

② linker的作用：用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。

③优点：a、可以用内切酶把插入片段切下来。

b、能给载体连接上Polylinker。

④缺点：

如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段，需进行甲基化保护及去保护，该操作较繁琐（对插入片段内部的酶切位点进行保护，切割完成后再去保护）。

（2）DNA接头 (adapter)连接法

1978年康奈尔大学的吴瑞教授发明。

① adapter：一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）的DNA序列。

② adapter的作用：用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。

但是接头本身也可以自身连接形成两端均为平端的接头，接到外源DNA和载体上后需用相应的酶切割后回收。

③优点：连上后就能用。

④缺点：接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。（需要连接上接头后切割回收，也可用⑤所示方法处理）

⑤防止自我连接：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。

（等将该接头连接在载体上后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）

三、PCR产物的连接

1. 在引物的5’端设计酶切位点

（1）设计原则：要符合载体的多克隆位点（便于插入）；避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复（防止将目的基因切断）。

（2）带酶切位点的引物的结构：每一条引物的3’端15~20bp与模板互补，5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。这样扩增出来的PCR产物两端就有酶切位点，有利于亚克隆。

2. 与T载体直接连接

（1）PCR产物两个3’端一般都有一个A：

Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双链的3’端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）。

（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T：利用末端脱氧核苷酸转移酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！

四、DNA体外连接应注意的事项

1、插入片断与载体的酶切位点互补：相同的粘性末端才能有效地连接，尽量避免平端连接。

2、DNA插入的方向正确：用双酶切：由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。

3、插入基因的开放阅读框（ORF）正确

（1）DNA定向插入：双酶切。

（2）注意起始密码子的位置。

4、防止载体自身环化连接

（1）提高插入片段的用量：连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。

（2）用碱性磷酸酶处理载体：载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接，但可以与插入片断以单链连接。

（3）用同聚物加尾法处理载体。

五、载体和外源DNA插入片段的连接结果

1. 载体自身环化连接（能存活）

2. 载体之间互相连接（能存活）

3. 插入片段互相连接（不能存活）

4. 一个载体与几个插入片段重组（能存活）

5. 几个载体与一个插入片段重组（能存活）

6. 一个载体与一个插入片段重组（能存活）

能存活是指有筛选标记（如抗性基因），不能存活则指不能形成克隆。重组DNA的目的是为了得到第6种结果，因此长出的菌落还要进行鉴定（如提质粒酶切或测序等）。