化学合成法与PCR法获得目的基因

一、化学合成法

1976年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。

（一）、目前常用的方法：磷酸二酯法、磷酸二酯法等

（二）、磷酸二酯法：

磷酸二酯法的基本原理是，将二个分别在5′-或3′-末端带有适当保护基的脱氧单核苷酸连接起来，形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸。
方法：DNA合成所采用的出发原料是脱氧核苷酸或脱氧单核苷酸；它们都是多功能团的化合物。必须将不参加反应的基团用适当的保护基因选择性地保护起来。这样，具5′保护的单核苷酸，便能够通过它的3′-OH 同另一个具有3′保护的单核苷酸的5′-P之间定向地形成一个二酯键，从而使它们缩合成两端均被保护的二核苷酸分子。实验中使用的各种不同的保护基团，有些可以通过酸处理移去，有些则可以用碱处理移去。一端脱保护的二核苷酸分子，比如带5′保护的二核苷酸分子，又能够同另一个带3′-保护的单核苷酸分子进行第二次缩合反应，形成一个三核甘酸分子。这样从缩合反应开始，到保护基团的消除，再进行新一轮缩合反应。如此反复进行多次，直到获得所需长度的寡聚脱氧核苷酸为止。

（三）、亚磷酸三酯法：

原理是将所要合成的寡聚核苷酸链的3′-末端先以3′-OH与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（CPG）连接，然后依次从3′-5′的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的（3’和5’都被保护），每接一个单体就是一个循环反应，每一循环包括：脱三苯甲基作用、缩合反应、封端反应和氧化作用。 

（四）DNA化学合成的用途

1、合成天然基因

如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等；

2、设计新型基因

3、制备探针、引物、接头

二、PCR法

PCR（Polymerase Chain Reaction）：聚合酶链式反应，它模仿体内DNA反复复制的过程，用DNA聚合酶在体外合成DNA。PCR技术能快速特异地扩增所希望的目的基因或DNA片段，能在实验室里的一支试管内，将所要研究的一个目的基因或某一DNA片段，在数小时内扩增至百万乃至千百万倍。1985年由Mullis K发明。 

使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。

PCR现已成为生命科学实验室获取某一目标DNA片段的一种常规技术，已广泛地应用于医疗工程、生物工程、遗传病和传染病诊断、肿瘤机制的探查、法医学和考古学等领域

（一）、PCR法定向扩增目的基因的基本原理

PCR方法模拟体内的DNA复制，首先加热使DNA双链变性为单链，然后退火（降温）至变性温度点以下，单链DNA与加入的小片段DNA引物复性，随后适宜温度下在耐热的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）作用下自引物延伸子链。不断重复高温变性、低温退火、适温延伸三个步骤，使样品DNA大量扩增。（前两个循环得不到所要的双链目的DNA）

 （二）、PCR的反应条件

1、反应体系：

①模板DNA（需扩增的目的基因或序列）；

②2种不互补的DNA片段引物，由寡核苷酸组成，15-30个bp；

③4种dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP），浓度一般为50-200µmol/L；

④耐热DNA聚合酶；

TaqDNA聚合酶：有很好的热稳定性，92.5℃处理130min，仍保留50%的酶活性。

⑤缓冲液（Tris-HCl）及镁离子Mg²⁺；

⑥其他成分：KCl、明胶、牛血清白蛋白等。

2、温度控制

反应开始时94℃加热2～5min使DNA完全变性，然后进入循环。每一轮循环包括：

①加热变性：95℃，60s，高温促使DNA变性成单链

②退火：38～65℃，60s，使单链DNA与引物结合（温度与Tm值有关，如GC含量）

③延伸：72℃，1～2min，Taq DNA最适温度促使DNA子链自引物延伸。

最后一次循环时延伸时间延长到10min，促使所有子链充分延伸（终延伸）。每一步的时间根据不同的DNA不同。

（三） 从mRNA中扩增: RT-PCR

（1）提取基因组总RNA；

（2）反转录合成总cDNA作模板

（3）根据目的基因序列设计引物

（4）PCR扩增

适合扩增真核生物基因，原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾，可直接提取基因组进行PCR扩增。

除此之外还有其他的PCR技术，如巢式PCR、多重PCR、不对称PCR、定量PCR、原位PCR等。以上内容以及引物的设计等自学。

（四）、PCR技术的应用

（1）核酸的基础研究

（2）序列分析

（3）检测基因表达

（4）从cDNA文库中放大特定序列

（5）研究已知片段邻近基因或未知DNA片段

（6）进化分析

（7）医学应用

（8）分析生物学证据

（9）性别控制

（10）转基因检测