目的基因：基因工程操作中准备要分离、改造、扩增或表达的基因。

一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。

基因文库法获得目的基因

基因文库（gene library or gene bank）：通过克隆方法保存在适当宿主中的某种生物、组织、器官或细胞类型的所有DNA片段构成的克隆集合体。

基因文库又分为：①基因组文库：含有全部基因；②cDNA文库：含有全部蛋白质的编码基因（不含非结构基因）。 

一、基因组文库的构建－鸟枪法

（一） 基因组文库：从生物组织细胞提取出全部DNA，用物理方法或酶法，将DNA降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体连接，并转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体，就称为基因组DNA文库（genomic DNA library）。

如果这个文库足够大，能包含该生物基因组DNA全部的序列，就是该生物完整的基因组文库，能从这文库中钓取该生物的全部基因或DNA序列。从基因组含有生物生存、活动和繁殖的全部遗传信息的概念出发，基因组文库是具有生物种属特异性的。

构建好的基因组文库，再用分子杂交等技术去钓取目的基因克隆的方法，称为鸟枪法或散弹射击法，意味着从含有众多的基因序列克隆群中去获取目的基因或序列。当生物基因组比较小时，此法较易成功；当生物基因组很大时，构建其完整的基因组文库就非易事，从庞大的文库中去克隆目的基因工程量也很大。

（二） 基因组文库的构建方法：

（1）载体的制备；

（2）插入片段的制备；

（3）载体与插入片段的连接；

（4）重组子导入宿主菌。

1、构建基因文库的载体选择

不同的载体容量不同，载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。

（1）对载体的要求

载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。

（2）目前常用的载体：      

质粒容量为15 kb，主要用于原核生物基因文库的构建；λ-DNA容量为24 kb；考斯质粒容量为50kb；YAC（酵母人工染色体）容量为1Mb；BAC（细菌人工染色体）容量为300kb（YAC和BAC主要用于大型基因组如动植物和人类基因组文库的构建）。

 2、载体的制备

①载体的酶切：单酶切，双酶切；注意选择能产生与基因组片段相匹配的黏性末端的酶,如BamH I。

②载体的去磷酸化：碱性磷酸酶处理，避免载体自身连接。

③载体的纯化：黏粒载体——酚－氯仿抽提、酒精沉淀

              噬菌体载体——蔗糖密度梯度离心

3、插入片段的制备

（1）基因组DNA的提取（见第二章）

为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性， 用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高。

用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在100 kb左右。

（2）、基因组DNA片段化

①、限制性内切酶法

用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片段。

这种方法的优点是切割后可产生粘性末端，产物可以直接与载体连接。缺点在于如果目的基因内部也可能有该内切酶的切点，目的基因也就被切成碎片（不完整）。

A、限制性内切酶局部消化法：控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。

a、内切酶识别位点的碱基数：影响所切出的产物的长度和随机程度。常用的有两种酶：

ⅰ、4bp的内切酶：平均每4⁴（256）bp一个切点。随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。

ⅱ、6bp的内切酶：平均每4⁶（4096）bp一个切点。（用得较少，切割出来的片段较大不易连接，可能一个片段中含有多个基因）。

b、内切酶粘性末端：能与常用克隆位点相连。如Sau3A I和BamH I。

B、机械切割法

a、超声波：超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片段。

b、高速搅拌：1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片段。

4、载体与插入片段的连接：

连接方法有直接连接、人工接头或同聚物加尾等。

① 粘性末端直接连接：载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端，如Sau3A I和BamH I可直接用T4 DNA连接酶连接。

②平端连接：人工接头、衔接物连接法或同聚物加尾（见第六章）。

5、重组子导入宿主菌

１、根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞：

如质粒载体常见的宿主细胞有：DH5a、HB101、JM101等。

（２）、重组质粒转化受体细胞：有转化法、转导法、转染法等（见第六章）。

转化之后即可获得基因组文库。那么基因组文库的大小怎么计算？

6、基因组文库的大小：

一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。             = 4.61×(G/F)

p: 文库包含了整个基因组DNA的概率（一般要达到99%）；

f: 插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数；

N：至少所需的重组载体数（克隆数）。计算公式见教材P₁₄₀。例如：人的基因组是 3×10⁹ bp，插入DNA片段的平均长度如果是1.7×10⁴ bp，则构建此完整的基因文库所需的重组克隆数最少为：N= 4.61×(G/F)=4.61×(3×10⁹/1.7×10⁴)=8.1×10⁵

二、cDNA文库的构建

（一） cDNA文库的定义：

提取出组织细胞的全部mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。

（二） cDNA文库的特点

（1）不含内含子序列。

（2）可以在细菌中直接表达：克隆于原核表达载体中。

（3）包含了所有编码蛋白质的基因。

（4）比真核生物DNA文库小的多，容易构建。

（三）构建cDNA文库的一般步骤：

载体的制备、cDNA片段的制备、载体与cDNA片段的连接、重组子导入宿主菌

1、cDNA克隆载体的选择

由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选用质粒，但对于较大的文库，则应选择噬菌体作为载体。

用碱性磷酸酶对载体进行去磷酸化处理，可防止载体自身环化，并保证重组分子的形成。

2、cDNA片段的制备

（1）总RNA的提取与mRNA的分离纯化

不同生物不同发育阶段，目的基因的转录水平不同，因而在提取总RNA时，应选择特定发育阶段的特定组织作为提取材料。提取总RNA有商业化的试剂盒。

根据mRNA3‘端具有ploy(A)结构的特性，利用结合了ploy(T)的纤维素柱层析法和磁珠分离法提取mRNA，最后还可以利用琼脂糖凝胶电泳、密度梯度离心等方法进行富集。另外，有时还要检测的完整性。

（2）cDNA第一链合成

用Oligo dT作引物（因为mRNA的3‘端具有ployA结构），在反转录酶作用下以mRNA为模板合成cDNA的第一链。

随后用碱处理或用RNaseH可降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。

（3）cDNA第二链合成

①、自身引导合成法：mRNA降解后剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。

随后用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉）。

②、置换合成法：RNaseH能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片段。小片段正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。随后利用DNA Pol I除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。

③、PCR合成法：

生成mRNA-DNA杂交链之后，在双链的3‘端加上多聚C尾巴，降解掉mRNA，设计引物（引物中含有多聚G），以此为引物进行单链PCR扩增即可得到cDNA的第二条链，优点是得到的cDNA完整。

（4）cDNA双链末端的处理

用上述方法合成的双链往往为平头末端，要与载体分子连接，需进行一定的处理，即使其变为粘性末端，一般多采用同聚物加尾法和接头法等

3、cDNA与载体的连接

将cDNA片段与载体DNA片段用T4DNA连接酶连接，应注意二者的比例（一般载体少，片段多）。

4、cDNA文库的生成

将连接好的重组分子与感受态大肠杆菌或其他受体混合，使其转化进受体细胞内。

三、从基因文库中获得目的基因

（一）对已知序列基因的分离

1、核酸杂交法－菌落的原位杂交（见第二章）

2、PCR筛选法：

基本策略：将某基因文库分装96孔培养板（也可用血凝板、ELISA板），经液体培养一段时间后，分别从各孔中吸取少量培养物，并将同一行和列孔中的培养物混合，以此混合物为模板进行PCR扩增，最后根据凝胶电泳的结果判定相应行或列混合孔中是否含有阳性克隆。对含有阳性克隆的行或列孔中的培养物再次分装培养板，并经培养后进行第二轮PCR，如此反复操作，直到获得阳性克隆或将其范围缩减到最小。

3、表达筛选：Ag-Ab反应：以表达载体构建文库，转化长菌后转膜，加入目的基因表达产物的抗体（抗血清、单抗），再加入二抗（同位素标记或酶标）进行检测。

（二）对未知序列基因的分离

1、染色体步移：

可有效地获得与已知序列相邻的未知序列。从第一个重组克隆插入片段的一端分离出一个片段作为探针从文库中筛选第二个重组克隆，该克隆插入片段含有与探针重叠顺序和染色体的其他顺序。从第二个重组克隆的插入片段再分离出末端小片段筛选第三个重组克隆，如此重复，得到一个相邻的片段，等于在染色体上移了一步，故称之为染色体步移。

    基因文库中的每一个克隆不可能都含有一个完整的基因，有些可能只含有一个基因的一部分，而有些则可能含有一个完整的基因以及与该基因相邻的一段序列。这样可设计与已知基因末端互补的探针去筛选剩下的克隆，那么筛选出的克隆中有的可能含有与探针互补的序列及其相邻序列，测序后即可测知该序列，然后再用同样的方法测知下面的序列，这样就可得到与已知基因相邻的未知基因的序列。

2、杂交捕捉和释放

用混合的cDNA克隆与mRNA进行杂交（该mRNA已获得，但不知其序列），然后将mRNA进行体外翻译，当翻译由于杂合分子的形成而受到抑制时，称为杂交捕捉转译。在此基础上，通过对混合cDNA克隆进行分组（比如分十组），并反复进行杂交捕捉转译（能翻译的组别弃掉，只留下不能翻译的组别，然后再分组），最终可以鉴定出抑制某一特定蛋白转译的单个cDNA克隆，测序后即可知该序列（该方法工作量大）。

若在杂交以后，用磁珠分离等方法提取cDNA－mRNA杂合分子，然后将其中mRNA的释放，并进行体外转译，从而鉴定编码该蛋白的cDNA克隆，称为杂交释放转译。