噬菌体载体

噬菌体是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖（即裂解性周期），或整合入宿主基因组中潜伏起来（即溶原性周期），而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。

    噬菌体的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：

①高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞  

②自主性复制能使外源基因在受体细胞中高效扩增

一、大肠杆菌的λ噬菌体DNA—双链噬菌体载体

（一）、λ噬菌体的生物学特性：

1、λ噬菌体的生物结构：大肠杆菌的温和型噬菌体，由外壳包装蛋白（二十面体对称结构）和λ-DNA组成。（由衣壳和核基因组组成）

2、λ噬菌体的基因组结构和功能

λ噬菌体的基因组是一条线性双链DNA分子，大小为48502bp，在分子的两端的5‘末端各有12个碱基的单链互补粘性末端，当进入细菌细胞后，通过粘性末端配对形成双链环状DNA，这种由粘性末端结合形成的双链区段称为cos位点，这是将DNA包装成噬菌体颗粒（完整的病毒颗粒）所必需的DNA序列。

迄今为止，在其上至少定位了61个基因，为了方便，将其分为3个区域：

    ①左侧区：编码外壳蛋白的全部基因；②中间区：非必需区，可被外源DNA片段取代；③右侧区：主要调节基因及复制基因和裂解基因

图中A~J为左侧区，J~N为中间区（复制非必需区），N~R为右侧区。

3、λ 噬菌体复制与包装

裂解性周期的早期复制方式为θ双向复制（形成复制眼结构），晚期为滚环复制（见分子生物学教材）。

（二）、λ-DNA载体的构建

野生型λ-DNA不适合直接用来作为基因工程操作的载体，因为它有缺点：

（1）基因组大且复杂，具有限制性内切酶的多个识别位点（不利于载体的处理）。

（2）外壳只能接纳一定长度的DNA分子（自身基因组的75～105％，即包装范围为原DNA的75～105％），因此只能克隆2.45kb左右的DNA片段

因此需要对对λ-DNA进行改造：

（1）切除非必需区段，扩充克隆容量；（2）去除必需区段限制性核酸内切酶位点，在非必需区段引入合适的限制性内切酶位点；（3）引入适当的选择性标记，便于重组子的筛选；（4）在某些必需基因中引入无义突变，使之成为安全载体（防止向环境中扩散）。

构建过程及方法：

1、删除重复的酶切位点

野生型的λ-DNA链上有多个重复的限制性内切酶位点，不利于重组操作，必须删除，只留下1 - 2个。同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点。除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶切位点

2、去除非必需区段，缩短长度

野生型λ-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型λ-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型λ-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的（基因组中的中间区）。

根据切除的多少和酶切位点的多少，可将λ-DNA分成两大类载体：插入型载体和取代型载体。

（1）插入型载体：

只有1～2种限制性核酸内切酶的单一切割位点（用内切酶切开一个切口后连入外源DNA），非必需区切除较少。如λgt10、λgt11、λBV2等，可承载较小的外源DNA片段，一般在10kb以内，广泛用于cDNA及小片段DNA的克隆。

（2）取代型载体：含有一个可以被外源DNA取代的片段的克隆载体。当外源DNA插入时，一对克隆位点之间的DNA片段便会被置换掉（用内切酶切掉一部分噬菌体DNA，连入外源DNA），从而有效提高了克隆外源DNA片段的能力。如charon4、charon10等，可承载20kb左右的外源DNA片段，常用来克隆高等真核生物的染色体DNA。

 3、加装选择标记

与质粒不同，野生型λ-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是λ-DNA克隆载体构建的重要内容。

λ-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：         免疫功能类标记、颜色反应类标记

（1）加装imm434标记（免疫功能类标记，含酶切位点）

imm434基因编码一种阻止λ-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的λ-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；

当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活，λ-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑。

（2）、加装选择标记lacZ’（ 颜色反应类标记）

lacZ’基因编码β-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ’基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体λ-DNA则产生蓝色透明斑

4、引入无义突变—构建琥珀密码子的突变体

琥珀型突变是指由CAG（Gln）向UAG的突变。

将野生型λ-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种λ-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白（翻译提前终止），也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散。

    大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。

基因工程实验中使用的受体就是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。

（三）、λ-DNA重组分子的体外包装

λ-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。

用于体外包装的蛋白质可直接从感染了λ噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：

一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份（都是噬菌体头部成分）。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组λ-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组λ-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的。

（四）、λ-DNA作为载体的优点：

1、可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌；

2、载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量；

3、重组λ-DNA分子的筛选较为方便；

4、λ-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因。常用的λ-噬菌体载体见教材P55-56（自学）。

二、大肠杆菌单链噬菌体载体

单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体（DNA为单链环状，噬菌体外形为丝状）：M13、f1、fd 噬菌体

单链DNA噬菌体的特点：（1）+DNA。（ssDNA）

（2）复制型（RF）是双链环状DNA，即复制过程中产生的复制型为双链环状的。

（3）RF DNA和ssDNA都能转染感受态大肠杆菌。并产生噬菌斑。

（4）不存在包装限制：λ-DNA有包装限制（75%-105%），单链噬菌体载体则没有，理论上可以插入大片段的外源DNA。

（5）可产生大量的含有外源DNA插入片段的单链分子（即拷贝数高），便于作探针或测序。

主要介绍M13 噬菌体

1、寄主：M13噬菌体只感染雄性大肠杆菌（带性菌毛的）。但M13 DNA可以转染雌性大肠杆菌。

2、DNA长度：6407 bp（比λ-DNA小，λ-DNA为48.5kb）。

3、基因组组成：由十个编码基因组成，基因Ⅰ~基因Ⅹ，其中基因Ⅱ和基因Ⅳ之间可插入外源DNA。

4、M13的生活周期：

M13通过雄性细菌的F性菌毛注入其+DNA，然后以+DNA为模板合成－DNA，形成复制型的双链DNA（RF dsDNA），然后－DNA转录为mRNA、合成+DNA、翻译形成噬菌体蛋白，然后组装成新的M13噬菌体颗粒。这个过程虽然不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，约为正常的1/2—3/4，即抑制细菌的生长）。

5、M13的包装过程：在宿主体内，M13基因V编码单链DNA结合蛋白，同时在RF dsDNA指导下合成的+DNA，两者结合为DNA-蛋白质复合物，转移到寄主的细胞膜上后基因V蛋白脱落，只留下+DNA，+DNA溢出细胞膜，在此过程中被mRNA翻译产生的M13外壳蛋白包装成M13噬菌体颗粒。

6、M13载体的构建：

（1）克隆区域的选定：

① 基因间隔区（intergenic region, IG区）

M13基因组中只有基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区，适于外源DNA的插入，其他基因之间只有很少的间隔序列，不适于外源基因的插入。

② 酶切位点：IG区内只有一个 BsuI 切点，其余9个BsuI限制性位点分布在其它部位。

J. Messing证明，IG区存在M13的复制起点，但可以插入外源DNA而不影响M13噬菌体的活力（因为基因Ⅱ和基因Ⅴ的突变可以弥补由于外源基因的插入导致的该缺陷）。

（2）加入酶切位点：

① 在IG区内加入单一内切酶位点

如第一个M13载体（M13mp1）：在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’（a-肽序列)。利用a-肽序列中的三个单一酶切位点（Bgl II、Ava II 和 Pvu I）。

M13mp1的构建过程：将M13的双链复制型DNA（M13 RF）用BsuI进行不完全消化，从而产生各种长度的线性片段，其中肯定有只在IG（基因间隔区）切开（而在其他的BsuI位点没被切开的）的线性全长M13 DNA。随后用HindII切割E.coli lac基因，分别可得到lacI、lacP、lacO、lacZ’片段，将这些片段与上述BsuI不完全消化的M13 DNA连接，然后转化入JM101宿主中，加入IPTG和X-gal，只有在IG区插入lacZ’才能出现互补的蓝噬菌斑，插入其他的基因不能出现蓝斑。另外，由于在其他BsuI位点均位于M13噬菌体的复制必须区内，因此插入外源基因形成的重组分子根本不能去感染宿主菌。

（3）M13载体系列

① M13载体系列的命名：M13mpn，n代表系列数字，如M13mp1、M13mp2等。

② 对M13mp1的改进：主要是加上常用的酶切位点。

如B. Gronenborn和J. Messing1978年把LacZ’ 5’端的第13个核苷酸G突变成A，产生了一个EcoR I切点，从而构建了M13mp2载体。

③ 对M13mp2的进一步改进即成为M13mp系列载体：在M13mp2的LacZ’的5‘端加上一段人工合成的多克隆位点（MCS），如M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19等，这些载体与相应的pUC系列载体有相同的MCS，如上述载体分别对应于pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。

7、 M13系列载体的优点

（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段；

（2）Xgal显色反应，可供直接选择：含有LacZ’基因；

（3）无包装限制，理论上克隆能力大，

（4）可以克隆双链DNA分子中的每一条链：子代M13噬菌体中包含的是单连+DNA（而不是双链DNA，因为M13本身为单链的）。

8、 M13载体的缺点

（1） 插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降

（2）实际克隆能力小于1500bp，虽无包装限制，并非无限包装（当插入片段大于1500个核苷酸时就很不稳定，容易在增殖的过程中丢失）。

另外外源基因虽然理论上可以以两种方向插入M13载体（只用一个内切酶切割后插入外源基因时可以以两种方向插入，因为外源基因两端的酶切位点是一样的。），但实际上总是按一种主要的方向插入。

三、噬菌粒载体

由质粒载体与单链噬菌体载体的复制起点结合而成的新型载体系列。

1、噬菌粒载体的特点

（1）分子量小：约3000bp（比M13小，M13为6.4kb）；

（2）克隆能力大：能插入10kb的外源DNA；

（3）两种复制形式：既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点，因此既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，又能在噬菌体内进行单链复制。

2、常见的噬菌粒载体：如pUC118/pUC119等。

（辅助噬菌体用来复制和包装噬菌粒载体）

3、pUC118/pUC119

（1）构成：①M13的基因间隔区（IG），带有M13复制起点。②pUC18/pUC19质粒载体，带有质粒复制起点、Amp^r、lacZ’和MCS。

（2）pUC118/119的复制模式

①双链质粒复制模式：受pUC本身的复制起点（来源于ColE1）的控制，每个细胞达到500个拷贝（宿主细胞未被辅助噬菌体感染时以这种方式复制，此时相当于质粒载体）。

②单链滚环噬菌体复制模式：当寄主细胞被辅助噬菌体M13感染后以这种方式复制。

4、PCR产物克隆载体—T 载体

Invitrogen公司开发的线性噬菌粒载体。

（1）结构：pUC的质粒部分、f1噬菌体ori、Kan^r和Amp^r抗性。

（2）特点: MCS的中部已经切开，各有一个3’端突出的T。PCR产物往往在3’端突出一个A，所以能与这个载体直接连接。

PCR产物一般都要先连接到T载体上，测序后（可用T7启动子引物）再亚克隆到表达载体上（直接连接效率低）。

四、 cosmid载体（粘粒）

1978年J. Collins和B. Hohn等人发展出来的。

1、大小：4-6kb

2、组成：l DNA的cos序列和控制包装的的序列（可进行体外包装），还有pBR322质粒的复制子、抗药性基因、几个限制性酶的单一位点。

3、特点：

（1）具有l噬菌体的特性：在寄主细胞内形成环化DNA（但不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌，因为它不具有形成完整噬菌体所需要的各种基因）。但是克隆外源DNA后可以体外包装成噬菌体颗粒。

（2）具有质粒载体的特性：大多带有pMB1或ColE1的复制子，能象质粒一样复制。

（3）方便的选择：有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位点。

（4）高容量的克隆能力：45kb （最少不能低于30kb）。

（5）可与同源序列的质粒进行重组：共存于同一宿主菌中时可重组为共合体。

cosmid载体主要用于真核生物的基因组文库的构建，但仍不如l噬菌体用的多。

除了上述单链噬菌体载体、双链噬菌体载体、噬菌粒载体和cosmid载体外还有其他的噬菌体载体，如pBluescript载体（即PBS载体）、噬菌体展示载体（是表达载体）等（自学）。

另外除了质粒载体、噬菌体载体外也还有其他载体，如动物病毒载体（痘病毒、腺病毒、反转录病毒、杆状病毒等，主要用于疫苗的构建，参见教材和生物制品学教材）、大分子DNA克隆载体（如酵母人工染色体、细菌人工染色体等）、基因打靶载体等（查资料自学）。

实际应用中要根据实验对象、实验性质、载体容量等方面选择载体。

小结

1、噬菌体载体也是常用的克隆载体，包括单链噬菌体载体、双链噬菌体载体、噬菌粒载体和cosmid载体等。

2、野生型λ-DNA不适合直接用来作为基因工程操作的载体，因此需要对对λ-DNA进行改造，如删除重复的酶切位点、切除非必需区段、引入适当的选择性标记等。

3、根据切除的多少和酶切位点的多少，可将λ-DNA分成插入型载体和取代型载体，前者可承载较小的外源DNA片段用于cDNA及小片段DNA的克隆，后者可承载20kb左右的外源DNA片段，常用来克隆高等真核生物的染色体DNA。

4、M13系列载体主要用于克隆单链DNA，但其克隆能力较小，其构建过程包括克隆区域的选定、加入酶切位点等。

5、噬菌粒载体由质粒载体与单链噬菌体载体的复制起点结合而成的新型载体系列，分子量小、克隆能力大、两种复制形式，常见的有pUC118/pUC119、T载体等。

6、cosmid载体既具有l噬菌体的特性又具有质粒载体的特性，主要用于真核生物的基因组文库的构建。