-
1 讲义
-
2 课件
第四章 基因工程载体
载体：是指基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载工具”，它的本质是DNA复制子。
1、载体的功能：
①运送外源基因高效转入受体细胞
②为外源基因提供复制能力（有复制子）或整合能力（如反转录病毒载体、噬菌体载体）
③为外源基因的扩增（克隆载体）或表达（表达载体）提供必要的条件。
2、载体必备的基本条件：
①分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。
②能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制（不依赖于基因组的复制，如松弛型质粒）。
③具有合适的限制性内切酶位点：EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ等，用于外源基因的插入，而且外源DNA插入其中不影响载体的复制。
④具有合适的筛选标记：抗药性标记，如抗氨苄青霉素、抗四环素、抗氯霉素、抗卡那霉素
⑤有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达（即具有强的启动子，指表达载体）。
⑥从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制（感受态细胞）等等。
3、载体的种类
①来源：质粒载体（如大肠杆菌质粒载体，枯草杆菌质粒载体等）、噬菌体载体（如双链DNA噬菌体载体：λ； 单链DNA噬菌体载体：M13）、柯斯质粒载体（λ噬菌体载体与质粒载体共同构建的）。本章主要介绍质粒载体和噬菌体载体（包括柯斯质粒载体）。
真核细胞克隆载体（如pCDNA系列载体、还有病毒载体等）。
②功能：克隆载体：主要是对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可；
表达载体：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子（需要结合RNA聚合酶转录）。
整合载体：把一个基因插入到染色体组中。
除此之外还有穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。
第一节 质粒载体
一、质粒
是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
1、质粒的生物学特性：
（1）分子小：1-200 kb（相对于基因组）
（2）编码基因少：2-3个中等大小的蛋白质。这些蛋白质具有一定的特性，如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（复制非必须，不影响细菌的正常生命活动）。
（3）环形状：自然状态的质粒都是双链环状的DNA分子，但也有例外，如酵母的“杀伤质粒”是RNA。
（4）、质粒的自主复制性
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。与基因组的复制无关。
（5）、质粒的不亲和（不相容）性
任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不亲和（不相容） 性，即两种类似的不同质粒不能存在于同一细胞中，当它们处在一起时，便有生存竞争，结果一种质粒繁殖，另一种逐渐被排斥，数目变少，如大肠杆菌的两种质粒ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容。
（6）、质粒的可转移性：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒和非接合型质粒，从安全角度考虑，基因工程中所用的主要是非结合型质粒。
（7）、携带特殊的遗传标记：如抗性标记、代谢特征标记等，这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。
2、质粒的空间构型：
① 共价闭合环状DNA（cccDNA）：呈超螺旋（SC）
② 开环DNA：（ocDNA）：一条链上有一至数个缺口。
③ 线形DNA （ linear ，lDNA）
二、质粒的类型
最常用的质粒是大肠杆菌质粒，其质粒，可以分为接合型质粒和非接合型质粒两种，前者具有自我转移功能，后者没有。
1、接合型质粒：又叫自我转移型质粒，除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。大肠杆菌可以进行有性繁殖，即雄性和雌性菌通过性菌毛进行遗传信息的交换，具有性菌毛的雄性菌具有F质粒，通过性菌毛将F质粒传递给雌性菌，即F质粒进行了转移。这种质粒不仅本身可以转移，甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中，因此不符合基因工程的安全要求。
2、非接合型质粒：虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞，因此符合基因工程的安全要求。
（1）R质粒（抗性质粒）：
带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。
（2）Col质粒：带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因。大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。
Col质粒或R质粒都有非接合型的，如Col E1质粒等，但如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒，如Col B质粒等。
三、质粒的复制类型：
1、严紧型质粒：复制行为与核染色体的复制同步，低拷贝数，一般一个寄主细胞内有1～3个，接合型质粒分子量大，一般属严紧型。
2、松弛型质粒：复制行为与核染色体的复制不同步，高拷贝数，在细胞内的数量可以达到10～200个或更多，非接合型质粒分子量小，一般属松弛型。因此，基因工程操作中通常选用松弛型质粒作为基因工程的载体，以获得高拷贝数。
四、理想质粒载体应必备的条件
质粒有很多种，那么是不是质粒本身具有了以上的特点就适合作为基因工程的载体了呢？回答：NO！
1、天然质粒作为载体的局限性
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。
例如ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1，colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因的内部。因此可以通过插入失活筛选（含外源基因的不能产生大肠杆菌素E1，不会形成噬菌斑，不含有外源基因的可以形成）。但细菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细胞，从而出现假阳性（不含外源基因的质粒也不能使其产生噬菌斑，从而被判断为阳性重组子）。因此其筛选标记不理想。
2、理想质粒载体的必备条件（P44-45）
（1）具有较小的分子质量和较高的拷贝数
（2）具有若干限制性核酸内切酶的单一酶切位点，以满足基因克隆的需求（多克隆位点，P45）
（3）具有两种以上的选择标记基因
（4）缺失mob基因：mob基因为转移蛋白基因，介导质粒在细菌间的自发转移，因此基因工程所用质粒必须缺失该基因。
（5）插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达
多克隆位点：或称限制性酶切位点库，是指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制性核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。
五、质粒载体的构建
质粒载体构建的基本策略：
１、能进行有效复制——复制起始位点（最好是多拷贝）
２、克隆位点——组装MCS
３、选择标记基因——抗性基因，Lac Z’基因
４、分子尽可能小（转化率高），＞15kb，转化率↓↓
５、组装各种“元件”，如启动子、终止子等
过程：严密的实验设计→构建（切割、修饰和连接重组）构建原则：
1、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如ori、选择标记、克隆位点、启动子和终止子
2、正确获得构建质粒克隆载体的元件
3、组装合适的选择标记基因
4、选用合适的启动子
5、构建过程力求简单
（一）、 质粒的选择标记及其工作原理：
1、选择标记：质粒的选择标记一般有两种，即抗菌素抗性标记和遗传标记。
（1）抗菌素抗性：绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记，如氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性等。
常用抗菌素的抗性工作原理：
①氨苄青霉素：青霉素的衍生物。
a）抑菌原理：通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌（大多数抗生素只能杀死那些正在生长繁殖的细菌，而对于休眠状态的细菌无作用）。
b）细菌抗性原理：Ampr基因编码b-内酰胺酶，特异地切割氨苄青霉素的b-内酰胺环，从而使氨苄青霉素失活。
②氯霉素：
a）抑菌原理：通过与50S核糖体亚基（大亚基）结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。
b）细菌抗性原理：Cmlr编码乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰化而失活。
③卡那霉素
a）杀菌原理：通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读，杀死细菌。
b）细菌抗性原理：Kanr编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。
④链霉素
a）杀菌原理：通过与30S核糖体亚基（小亚基）结合，导致mRNA错译。杀死细菌。
b）细菌抗性原理：Strr编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体30S亚基结合作用。
⑤四环素
a）抑菌原理：通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。
b）细菌抗性原理：Tetr编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。
除此之外还有其他的抗生素抗性基因，如庆大霉素抗性基因等。
（2）遗传标记：使受体菌发生遗传性状的改变的基因，有很多，如常用的LaZ筛选标记（蓝白筛选标记）。
2、抗菌素选择原理：不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长,当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。
既然天然质粒不适于作载体，就要对其改造，人工构建。
（二）、人工构建的质粒载体的类型
1、高拷贝数的质粒载体
如ColE1派生质粒具有高拷贝数的特点。而且在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质合成抑制剂等存在下）仍能复制（即使宿主菌不能复制，质粒也能高拷贝复制），达到每个细胞的拷贝数1000-3000个。这种质粒适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。
2、低拷贝数的质粒载体
由pSC101（见后面）派生来的载体特点是分子量小，拷贝数低，如pLG338、pLG339、pHSG415等。不适合大量扩增DNA用，但有特殊用途，即当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。
3、失控的质粒载体（又称温度敏感性质粒）：这是一类温度敏感型复制控制质粒。在不同温度下表现出不同的拷贝数。
4、插入失活型质粒载体：载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。插入外源基因后引起该标记基因的失活。如pDF41、pDF42、pBR322等。
5、正选择的质粒载体：转化后可以直接选择转化后的细胞。只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。如pUR2、pTR262等。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。（因为都带有选择性标记，转化后能长菌说明转化菌细胞中含有质粒，不含质粒的细菌在选择性培养基上不能生长。但其中的质粒是不是重组子还得鉴定，当然也有些正选择质粒只要长菌就含有阳性重组子，如pTR262）
pTR262是正选择质粒。在这种质粒中，在四环素的抗性基因（Tetr）前有λ噬菌体的PR启动子，同时在这种载体中还带有λ噬菌体编码CI蛋白质（阻遏物）的基因。没有外源基因插入时，由于CI蛋白质阻遏从PR进行的转录作用，因此对四环素不表现抗性。在CI蛋白质基因上有单一的HindⅢ和BclⅠ切点，若利用其中任何一个切点插入外源DNA片段，都可以使CI蛋白质基因功能丧失，结果PR激活Tetr基因表达；表现出对四环素的抗性，达到正选择的效果。
除此之外还有一些其他的人工构建质粒，如测序质粒、穿梭质粒、探针质粒等等。
（三）、经典的大肠杆菌质粒载体
目前基因工程操作中所用质粒载体很多，来源也很多（大肠杆菌、枯草杆菌、分枝杆菌等），但最常用的还是来源于大肠杆菌的质粒载体。
1、pSC101：第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体
（1）类型：天然质粒，属低拷贝型。
（2）长度：9.09 kb
（3）选择标记：四环素抗性（Tetr）
（4）克隆位点：6个克隆位点：EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I。主要使用EcoR I。其中Hind III、BamH I、Sal I 3个位于选择标记Tetr的内部，因此属于插入失活型质粒载体
2、pBR322：F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工构建的载体。
（1）元件来源：
① 复制起点 ori：来源于ColE1质粒的衍生物pMB1系列的高拷贝型复制起点（拷贝数 50 - 100 / cell，经过氯霉素扩增后，每个细胞可累积1000～3000个拷贝）。
② Ampr基因：来源于pSP2124质粒易位子Tn3。
③ Tetr基因：来源于pSC101。
（2）长度：4363bp
（3）选择标记：氨苄青霉素和四环素抗性。
（4）克隆位点：24个克隆位点。其中9个会导致Tetr基因失活（如BamH I、Hind Ⅲ、Sal I）；3个会导致Ampr基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。
（5）pBR322的优点：
① 双抗菌素抗性选择标记：可以利用插入失活进行两次选择，有利于重组子的筛选（见第七章）。
② 分子小，克隆能力大：小载体克隆能力大，>10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。
③ 高拷贝数：氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000个拷贝。
（氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，从而有利于松弛型质粒的复制）。
④ 安全：失去了转移蛋白基因mob。不能通过接合转移。
（6）pBR322的缺点：虽然缺失了mob基因，但仍保留了转移蛋白（mob）的作用位点。因此能够被大肠杆菌ColK质粒编码的mob蛋白识别，如果再有F质粒的参与，就有可能转移（比如转化的宿主菌为大肠杆菌则可能发生这种情况）。
（7）PBR322的改进
① 删除mob识别位点：（如质粒pBR327、pAT153等），防止其转移。
② 改造EcoR I 位点：更加易于筛选。如pBR325：使EcoRI 也成为插入失活型位点。在pBR322位点上接入一段来自噬菌体PICm的HaeII酶切片段（带有氯霉素抗性基因cmlr），cmlr上带一个EcoRI位点，从而使该EcoRI 成为插入失活位点。
（8）PBR322的构建：
出发质粒是大肠杆菌质粒pMB1。首先将沙门氏菌R1质粒的变异质粒R1drd19含AMP+的Tn3易位子转到pMB1上，构建质粒pMB3，但该质粒太大（转化效率低），因此再用EcoRI的星号活性切除掉一部分非必需区，成为pMB8（失去了AMP+）。再将pSC101的四环素抗性基因连在pMB8上，构建成pMB9。再由pSF2124上引入AMP+基因，成为pBR312，再用EcoRI的星号活性切除掉一部分非必需区，成为pBR313。再分别除去两个PstI位点和EcoRII片段，分别获得质粒pBR318和pBR320，再用连接酶将其连接起来获得质粒pBR322。
3、pUC系列
（1）元件来源：
① 复制起点：来源于pBR322
② Ampr 基因：来源于pBR322，但其上失去了克隆位点（某些限制性酶切位点缺失了，如PstI）。
③ lacZ的启动子：来自于大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因的启动子。
④ lacZ’基因：由lacZ的启动子和a-肽共同组成，a-肽是LacZ基因编码蛋白（β-半乳糖苷酶）的氨基端片段。
⑤ 多克隆位点：位于lacZ’基因的5 ’端。
（2）长度：约2.7kb
（3）克隆位点: 10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的5’端。
比较常用的pUC载体是pUC18和pUC19，两者唯一的区别是多克隆位点的方向相反。
（4）选择标记：有两个选择性标记，一个是Ampicillin 抗性，另一个是 lacZ的a肽互补现象（蓝白斑筛选）。
蓝白斑选择原理：
①X-gal：为底物
② b-半乳糖苷酶Xgal显色反应：lacZ基因编码的b-半乳糖苷酶能把无色的化合物X-gal分解成半乳糖和一个蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。
但是pUC质粒中不含有完整的lacZ基因，只含有氨基端的a肽，必需与羧基端互补后才能形成完整的b-半乳糖苷酶，这就涉及到a肽互补现象。
③ lacZ的a肽互补：
1）a-肽（ lacZ’的一部分）：b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片段（11-41氨基酸）。必须与C端连接后才能成为完整的lacZ基因。而且lacZ编码的b-半乳糖苷酶必须是四聚体才有功能。
一般的大肠杆菌本身具有完整的b-半乳糖苷酶基因（lacZ基因），因此培养物中加入x-gal后会变蓝。但是基因工程操作中所用的宿主菌是lacZ基因突变的菌株。
2）受体菌lacZ突变：突变后的基因称为lacZ∆M15。
受体菌基因组的b-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失a肽），只含有C端，因此不能形成4聚体的活性酶，不能分解X-gal。
3）a互补：pUC质粒载体上的lacZ’ 编码a肽与宿主菌中缺失突变的b-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。又能分解X-gal，产生蓝色物质。
4）a互补的插入失活
pUC载体上LacZ’的5‘端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ’的合成（因此空载体转化宿主大肠杆菌后加入x-gal，可使菌落呈蓝色），但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成（破坏了a肽的编码基因），不能互补。
MCS虽也是一段序列，但构建pUC载体时是通过密码子的简并性获得的这些位点，因此它的存在不会干扰a肽的翻译。
另外要发生a互补现象还需要一个条件，即必需有诱导物的存在宿主菌才能表达b-半乳糖苷酶的C端部分，载体才能表达a肽（参见乳糖操纵子）。
④ IPTG的诱导作用：IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ 的C端部分和载体的lacZ’ a肽都表达。从而互补。
但是如果载体中插入了外源基因，即使存在诱导物，重组质粒也不能合成完整的a肽，因此菌落是白色的。
因此通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。（但是挑取白斑后，仍然要提取质粒进行酶切或测序鉴定，因为如果加入的IPTG量少或X-gal过期失效，那么含空载体的菌落也可能是白色的）
（5）pUC系列载体的优点
① 更小的分子量：比pBR322小得多
② 选择方便：X-gal显色、抗菌素双重直接选择。
pBR322需要进行两次选择。
③ 克隆便利：具有多克隆位点（MCS），使有两个不同粘性末端的外源DNA方便地插入。
④ 测序方便：pUC的MCS与M13噬菌体载体的MCS完全相同，便于把外源DNA转移到M13载体上测序。（根据M13载体的启动子序列可设计测序引物，不管外源基因如何，均可用其测序。）
⑤拷贝数高：远远高于pBR322。
4、pGEM-3Z：由pUC派生而来，与pUC的主要区别是在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子T7和SP6，因此可被T7和SP6的RNA聚合酶识别转录。
pGEM-3Z的特点：
① 如果加入纯化的T7或SP6 RNA聚合酶，在试管里就可以转录mRNA，即在体外即可转录。但是由于T7和SP6启动子只能特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等。
② 外源基因正接反接都可以转录（因为插入为点两端都有启动子）。
③ MCS与pUC18的完全一样。
5、pGEM-4Z：与pGEM-3Z相同，只是T7启动子和SP6启动子的位置互换。
六、常用的质粒载体类型
（一）、克隆质粒载体：pBR322、pUC、T载体等
（二）、表达质粒载体
1、定义：专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体。如pGEX系列、pET系列等
2、特点：
（1）具有强的启动子，如Lac、T7、Tac、PL、PR
（2）核糖体结合位点：SD序列（与目的蛋白的翻译有关）
（3）具有转录终止子，位于外源基因的下游（多克隆位点的下游，终止转录）
（4）分泌型表达载体还具有信号肽编码序列，位于启动子之后，外源基因之前（信号肽与蛋白的分泌有关，如在真核细胞内表达时，蛋白的翻译在胞浆内进行，信号肽可将合成的蛋白带到细胞膜上（动物细胞）或与细胞壁之间的周质空间中。）因此为了获得分泌性蛋白可选用泌型表达载体或者使外源基因上带有信号肽的编码序列。
3、分类：非分泌型表达载体（如pBV221）和分泌型表达载体（如pTA529）
另外根据在原核还是在真核细胞内表达又分为真核和原核表达载体，两者所用的启动子不同，真核表达载体所用启动子一般都是哺乳类动物病毒的启动子，而原核表达载体启动子一般为细菌的或者噬菌体的，因此可被不同的RNA聚合酶识别。原核表达载体如pGEX系列、pET系列等；真核表达载体如pCDNA系列。
（三）、多功能质粒载体
1、定义：可以根据需要进行体外转录、克隆、测序、基因表达等方面的基本操作的载体分子
2、常用多功能质粒为pGEM系列
（四）、穿梭质粒载体
定义：是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。亦可在原核和真核细胞之间往返穿梭。
如大肠杆菌－枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌－酿酒酵母穿梭质粒载体、大肠杆菌－土壤农杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌－牛乳头瘤病毒穿梭质粒载体、大肠杆菌－分枝杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌－哺乳动物细胞穿梭质粒载体等。
对于穿梭质粒，通常均为在大肠杆菌中进行基因操作（如定点突变），而在另一受体细胞中进行表达。
穿梭载体的优点
① 利用大肠杆菌进行基因克隆、表达
② 也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。
③ 可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。
小结
1、载体：是指基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载工具”，它的本质是DNA复制子，只有具备一定的条件才可作为基因工程的载体。
2、人工构建的质粒载体的类型有高拷贝数的质粒载体、低拷贝数的质粒载体、失控的质粒载体、插入失活型质粒载体、正选择的质粒载体等。
3、常见的大肠杆菌质粒载体有pBR322、pUC系列载体、pGEM-3Z、pGEM-4Z等，不同的质粒构建方法有所不同。
4、常用的质粒载体类型有克隆质粒载体、表达质粒载体、多功能质粒载体、穿梭质粒载体等。
