核酸修饰酶

一、末端脱氧核苷酸转移酶

1. 来源：小牛胸腺

2. 组成：大小两个亚基。

3. 特性：5’®3’DNA聚合酶活性

① 需要3’-OH、 Mg²⁺或Co²⁺ 

② 不需要模板。（DNA聚合酶需要模板）

③底物可以是双链DNA的3’-OH突出端。也可以是双链DNA的3’-OH凹陷端、平末端、单链DNA，但是必须用Co²⁺代替Mg²⁺才可以。

④ 随机添加的dNTPs（因为没有模板）。如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。

4. 末端转移酶的用途

（1）同聚物加尾：给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。

（2）再生酶切位点：便于回收克隆片段。

（3）标记DNA片段的3’端：催化放射性或非放射性标记物参入DNA片段的3’端。

二、T4多核苷酸激酶：

1. 来源：T4噬菌体的pseT基因编码。从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。另外，多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。

2. 功能：催化g-磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH端。不论5’-OH端突出与否。

但天然的DNA的5’端都是磷酸化的。因此首先要用碱性磷酸酶处理。

3. 多核苷酸激酶的用途：DNA 5’-OH端磷酸化、标记DNA的5’端。

（1）正向反应：用碱性磷酸酶将5’-P转变为5’-OH，再用多核苷酸激酶以含有g-³²P的ATP进行反应，从而将5’标记。

（2）交换反应标记法：反应混合物中具有超量（g-³²P）ATP和正常的ADP时，多核苷酸激酶能催化（g-³²P）ATP的g-³²P与DNA5’端的磷酸交换。

三、碱性磷酸酶

1. 碱性磷酸酶种类

（1）细菌性碱性磷酸酶（BAP）：从大肠杆菌中分离出来，具有抗热性。

（2）小牛肠碱性磷酸酶：从小牛肠中纯化出来，SDS中加热68℃可完全失活。

2. 碱性磷酸酶的特性：催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。

3. 碱性磷酸酶的功能：防止线性化的载体份子自我连接：单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。如HindⅢ酶切后，再用碱性磷酸酶处理，形成5’-OH，5’-OH与3’-OH不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。

而同一酶切后的外源DNA的5’端有P，能与脱磷酸的载体3’-OH连接。但外源DNA的3’ -OH与载体的5’ -OH连不住，因此连接后的DNA双链上，每条链上都有一个nick，但转入细菌后会被修复（在聚合酶和连接酶的作用下被修复）。